HIV-1整合酶活性检测方法建立和应用研究

摘要

人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）是人类历史上最严重、最致命的疾病之一。艾滋病目前仍然不能治愈。HIV编码的整合酶(IN)介导病毒DNA与宿主细胞基因组整合，是病毒复制所必需的关键酶之一。抑制IN的功能能够有效阻断病毒在宿主细胞内的复制。同时，由于正常人体细胞中没有IN的功能类似物，特异性作用于IN的抑制剂对人体的副作用可能很小。因此，IN被认为是抗HIV药物研发的理想靶点。
　　 IN在体内主要通过催化3＇加工和链转移两步反应实现整合过程。以上两步反应能够在体外使用重组IN蛋白、寡核苷酸DNA底物以及二价金属辅助离子实现。此外，IN还能在体外催化链转移的逆反应——去整合，将链转移形成的DNA产物重新还原生成病毒DNA和靶DNA。建立高效的IN活性检测方法，并据此开展抑制剂的筛选，是当前IN抑制剂体外筛选的主要手段，也是以IN为靶点的抗病毒药物研发的热点之一。本研究表达纯化了重组IN蛋白，建立了IN活性检测的一系列高通量方法，并应用这些方法进行了IN的性质、抑制剂筛选等方面的研究。论文内容主要包括以下几个方面：
　　 (1)整合酶蛋白表达纯化及3＇加工活性高通量检测方法的建立
　　 使用PCR获取了HXB2CG病毒株IN基因，通过序列分析，设计突变引物，使用重叠PCR方法将HXB2CG IN基因突变为HIV NL4-3 IN基因，并引入了F185K/C280S突变以提高蛋白溶解性。将目的基因连接到pET表达载体中，在大肠杆菌BL21中实现了高效且可溶性表达。通过亲和层析方法，从细胞破碎上清液中纯化到纯度高且具有3＇加工和链转移功能活性的重组IN蛋白。
　　 根据分子信标的原理，设计了荧光基团和淬灭基团标记的模拟病毒DNA序列的3＇加工DNA底物，提出了一种检测3＇加工反应活性的新型荧光分析法。实验表明，该方法不但灵敏度、特异性高，操作简单，方便快捷，为全液相反应环境，而且能够实时定量监测IN3＇加工反应。该方法能够用于IN3＇加工反应性质研究和以3＇加工为靶标的IN抑制剂高通量筛选。本研究建立的3＇加工反应荧光检测方法有潜力应用到其他蛋白质与DNA相互作用的研究中，具有重要的学术和应用价值。
　　 (2)整合酶链转移活性高通量检测方法的建立和应用
　　 抑制链转移反应被认为是体内抑制IN功能活性的关键，当前IN抑制剂的体外筛选主要以链转移反应为靶标。本研究设计合成了分别用生物素和地高辛修饰的供体DNA和靶DNA，引入了链霉亲和素磁珠捕获反应DNA产物，提出了检测IN链转移反应活性或者检测3＇加工与链转移反应整体活性的高通量酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
　　 与之前的各种方法相比，我们提出的高通量ELISA具有明显的改进：(ⅰ)无需使用放射性底物，实现了高通量；(ⅱ)反应时所有的试剂均自由悬浮在液体环境中，磁珠-DNA产物、磁珠-抗体接触更容易更充分，显著提高灵敏度，还能灵活应用到研究反应中各试剂的相互作用，有助于研究抑制剂的作用机理；(ⅲ)无需包被、封闭微孔板，省时省力，检测前转移磁珠至新的微孔板能够几乎完全消除微孔板对试剂的非特异性吸附，有效降低了背景值，提高了特异性；(ⅳ)ELISA和荧光免疫吸附测定(FLISA)两种检测策略并用，增加了方法的应用范围。
　　 成功应用高通量ELISA研究了金属离子对链转移反应的影响，得出了一些有意义的结果。使用已知IN抑制剂证明了高通量ELISA应用到IN抑制剂筛选中的有效性，且从天然产物提取物和合成化合物中成功筛选了数个具有初步活性的IN抑制剂。
　　 (3)整合酶去整合活性高通量检测方法的建立
　　 IN在体外能通过去整合反应实现对整合过程的逆转，且整合酶核心区(IN-CCD)具有独立催化去整合功能。建立去整合活性高通量检测方法对研究IN功能及筛选IN抑制剂都具有重要意义。本研究表达纯化了具有功能活性的野生型IN及IN-CCD蛋白，设计合成了生物素和地高辛双标记的去整合DNA底物，基于链霉亲和素磁珠捕获生物素标记DNA，建立了一种检测IN和IN-CCD体外去整合活性的高通量ELISA。
　　 研究了金属离子对去整合高通量ELISA的影响，结果表明与3＇加工和链转移反应相似，IN去整合反应也更偏好于使用Mn2+而不是Mg2+为金属辅助离子。进一步使用NaCl滴定实验分析表明，IN去整合对Mn2+的选择偏好性与Mn2+比Mg2+更能稳定IN-DNA复合物有关。使用了已知IN抑制剂baicalein验证去整合高通量ELISA筛选IN抑制剂的有效性，证明了baicalein是明确的以IN-CCD为靶标的IN抑制剂。本研究建立的去整合高通量ELISA具有高通量、高灵敏度、高特异性、低背景、省时省力等优点，能够应用到去整合反应、抑制剂作用机理等研究中，且具有应用到以IN为靶标，特别是以IN-CCD为靶标的抑制剂高通量筛选的潜力。
　　 野生型(wT)IN和IN-CCD溶解性较差，在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体，给后期纯化及蛋白质功能研究带来不便，而F185K突变后IN和IN-CCD能实现可溶性表达且活性不受影响。通过构建、表达、纯化得到WT和F185K突变型IN-CCD，比较了其溶解性和活性差别。分析并比较了WT和F185K/C280S突变型IN蛋白溶解性和活性差别。结果表明，F185K和F185K/C280S突变后IN和IN-CCD的溶解性显著提高，能够实现可溶性表达；同时，突变后IN-CCD的去整合活性有一定程度的降低，IN的3＇加工和链转移活性有一定程度降低。
　　 进一步通过同源模建，构建了WT和F185K突变型IN-CCD的蛋白结构，并在水溶液中进行了1800ps的分子动力学(MD)模拟，得出了一些有意义的结果：(ⅰ)F185K突变后，体系的功能loop区柔性有一定程度的降低，整体运动性略有减小，催化核心DDE基序残基之间距离无显著变化，因此，突变后蛋白催化活性降低，但活性受影响程度不大；(ⅱ)F185K突变对IN-CCD内部静电相互作用网络的改变驱动了蛋白构象的变化，特别是loop区构象变化明显，引起蛋白表面的部分疏水残基被包埋，亲水残基暴露，造成IN-CCD相对的极性溶剂可接近面积增大。同时，F185K突变后蛋白与水之间形成的氢键数量有明显的增加，这些变化使IN-CCD的溶解性显著提高。MD模拟与实验结果相吻合。该工作为理解蛋白质溶解性和蛋白质工程中蛋白质可溶性改造提供了一些有价值的信息和理论依据。

目录

文摘

英文文摘

主要英文缩略词

第1章 绪论

1.1 HIV和艾滋病概述

1.1.1 艾滋病的流行现状

1.1.2 HIV-1的结构

1.1.3 HIV-1的生活周期与致病过程

1.2 艾滋病防治的研究进展

1.2.1 艾滋病的化学药物治疗

1.2.2 艾滋病疫苗研制进展

1.2.3 中草药在艾滋病防治中的应用

1.2.4 基因治疗及其他防治艾滋病的方法

1.3 以整合酶为靶点的抗艾滋病药物研究进展

1.3.1 整合酶的结构和功能

1.3.2 整合酶抑制剂的研究进展

1.4 以整合酶为靶标的抑制剂筛选方法研究进展

1.4.1 放射自显影方法

1.4.2 基于微孔板的酶联免疫吸附测定法

1.4.3 基于荧光共振能量转移方法

1.4.4 其他检测方法

第2章 整合酶蛋白表达纯化及3＇加工活性高通量检测方法的建立

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 重组整合酶蛋白表达质粒pNL-IN的构建

2.3.2 重组整合酶蛋白的表达纯化及功能鉴定

2.3.3 整合酶3＇加工反应活性高通量检测方法的建立

2.3.4 应用整合酶3＇加工反应活性高通量检测方法测定整合酶抑制剂

2.4 本章小结

第3章 整合酶链转移活性高通量检测方法的建立及应用

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 整合酶链转移反应活性高通量ELISA检测的原理

3.3.2 整合酶链转移反应活性高通量ELISA检测的结果

3.3.3 应用高通量ELISA研究金属离子对整合酶链转移反应的影响

3.3.4 应用高通量ELISA筛选整合酶抑制剂的有效性

3.3.5 应用高通量ELISA从真菌代谢产物中筛选整合酶抑制剂

3.3.6 应用高通量ELISA测定合成化合物对整合酶活性抑制效果

3.3.7 高通量ELISA的统计分析结果

3.4 本章小结

第4章 整合酶去整合活性高通量检测方法的建立

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 PCR引物合成

4.2.2 寡核苷酸链底物合成修饰

4.2.3 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 野生型整合酶和整合酶核心区蛋白的表达纯化及活性鉴定

4.3.2 去整合高通量ELISA的灵敏度和特异性

4.3.3 应用去整合高通量ELISA研究金属辅助离子的选择偏好性

4.3.4 应用去整合高通量ELISA测定抑制剂对整合酶活性的影响

4.4 本章小结

第5章 整合酶核心区野生型和F185K可溶性突变型活性和溶解性研究

5.1 引言

5.2 材料和方法

5.2.1 分子生物学实验

5.2.2 整合酶核心区模型搭建

5.2.3 分子动力学模拟

5.3 结果与讨论

5.3.1 野生型和F185K突变型整合酶核心区溶解性和活性比较

5.3.2 分子动力学模拟结果分析

5.3.3 溶剂可接近面积与氢键分析

5.3.4 整合酶核心区蛋白的结构分析

5.4 本章小结

结论与展望

主要结论

论文创新点

展望及建议

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文和申请专利

致谢