KAP-1复合体参与β-珠蛋白基因座基因表达调控的分子机制研究

摘要

红系分化是造血作用的重要组成部分,对其分子机制的研究具有重要理论意义及潜在应用价值。红系分化调控的核心环节是β-珠蛋白基因座基因表达调控。尽管已发现一系列顺式作用元件和反式作用因子参与β-珠蛋白基因座上诸基因精密的表达调控,以使其依特定时空次序活化或沉默,但具体机制及各转录调控复合体间功能的关联尚未完全知晓。因此,参与此过程的新的转录调控复合体成员的鉴定及其与已知调控因子或顺式作用元件的相互作用研究必将为阐明β-珠蛋白基因座动态的基因表达调控机制提供宝贵线索,并可加速该领域相关的临床应用基础研究。本室前期研究结果表明,通过KAP-1(KRAB-associated protein1)这一重要转录中介因子形成的复合体(KAP-1复合体)在红系终末分化中发挥负调控β-major珠蛋白基因及Ey基因转录的作用,但具体分子机制尚未阐明。本研究从“KAP-1复合体DNA结合位点”及“与KAP-1相互作用的序列特异性转录因子”两个角度,进一步探索了KAP-1复合体参与红系终末分化调控的具体分子机制。
　　 首先,为明确KAP-1复合体是否直接结合于β-珠蛋白基因座及其结合区域,我们选择β-珠蛋白基因座中已知的参与β-major珠蛋白基因及Ey基因转录调控的顺式作用元件所在区域(包括这两个基因的启动子区域及HS2、HS3区),检测MEL细胞中KAP-1复合体是否与这些DNA位点相结合。结果发现KAP-1复合体能够与β-珠蛋白基因座中Ey基因启动子区及β-major珠蛋白基因启动子区结合。
　　 KAP-1作为复合体中的桥梁分子,一般不直接与DNA结合。为明确KAP-1复合体上述调控作用的具体分子机制,我们有必要对与KAP-1相互作用的序列特异性转录因子进行进一步探索。本室前期研究利用IP-MS/MS技术鉴定到一系列在MEL细胞中可能与KAP-1存在内源性相互作用的蛋白质,其中包括MafK这一已知的红系分化转录调控因子。本研究进一步验证了KAP-1与MafK之间相互作用的可能性:①利用PRINCESS软件对KAP-1与MafK转录抑制复合体中成员相互作用的可能性进行预测分析,结果表明KAP-1分子与MarK及Bach1两个成员有较强的相互作用可能性。②利用免疫共沉淀(Co-IP)技术证实了KAP-1与MarK及Bach1均可以发生相互作用。③利用GSTpull-down技术,我们发现KAP-1能够与MafK在体外发生直接的相互作用,而不能与Bach1发生直接相互作用。利用三元复合物外源Co-IP检测,我们同样证明了KAP-1与MafK的相互作用并不依赖Bach1的存在。④利用蓝色温和-聚丙烯酰胺凝胶电泳-Westernblot(BN-WB)实验证实了MEL细胞中KAP-1有可能与MafK共同存在于同一复合体中。结合前述KAP-1在β-珠蛋白基因座结合区域检测结果,我们可以得到这样的推断:KAP-1与MafK共同结合于β-major珠蛋白基因的启动子区,负调控该基因转录,并且该转录调控复合体中可能不含有Bach1分子。
　　 那么,KAP-1负调控Ey基因转录的具体分子机制是怎样的呢?本室前期利用RNA干涉(RNAi)技术研究发现Zfp445可能通过KAP-1负调控Ey基因,本研究通过对Zfp445过表达并检测其对MEL细胞中β-珠蛋白基因座基因变化的影响,发现Zfp445持续过表达会降低NaB刺激过程中Ey基因的活化水平,进一步证实了Zfp445可以负调控Ey基因转录的结论。
　　 上述结果表明,KAP-1复合体可直接结合于β-珠蛋白基因座对其进行表达调控;且发现KAP-1可能通过与MarK相互作用参与β-majior珠蛋白基因负调控,通过与Zfp445相互作用参与Ey基因负调控。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

第1章 绪论

1.1 β-珠蛋白基因座基因表达调控机制研究的重要意义及潜在应用价值

1.2 β-珠蛋白基因座基因表达调控机制研究现状

1.2.1 β-珠蛋白基因座基因表达调控的主要参与者

1.2.2 β-珠蛋白基因座基因表达调控的主要分子机制

1.3 KAP-1复合体参与β-珠蛋白基因座基因表达调控

1.4 本研究的目的、意义

第2章 KAP-1复合体参与β-珠蛋白基因座基因表达调控的分子机制探索

2.1 KAP-1复合体在β-珠蛋白基因座中结合区域探索

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.1.3 实验结果

2.2 KAP-1复合体中参与调控β-major珠蛋白基因的成员探索

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 实验结果

2.3 Zfp445参与Ey基因负调控

2.3.1 实验材料

2.3.2 实验方法

2.3.3 实验结果

2.4 讨论

2.4.1 KAP-1复合体与β-珠蛋白基因座结合方式的探讨

2.4.2 KAP-1与MafK相互作用发挥调控功能的机制

2.4.3 Zfp445对Ey基因的负调控

2.5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢