源于条纹斑竹鲨的抗人CD146单域抗体研究

摘要

背景：神经胶质瘤是最常见的恶性原发性脑肿瘤，传统疗法包括手术、化学疗法和放射疗法，临床预后效果十分有限，而血脑屏障的存在使靶向药物的研究进展推进缓慢。对胶质瘤进行分子标志物的分型是评价肿瘤恶性程度以及设计治疗方案的重要方法。CD146是一种粘附分子，在包括脑胶质在内的多种肿瘤中发现高表达，且与肿瘤的侵袭和浸润性相关。目前靶向CD146的药物治疗已经在多种肿瘤中获得良好的效果，如何能够高效穿透血脑屏障精准靶向脑胶质瘤CD146是一个亟待解决的问题。在软骨鱼中发现的仅含有重链的IgNAR的可变区VNAR的分子量仅有12-15kDa，可以有效的穿透血脑屏障，且具有极高的抗原亲和特异性以及稳定性，为脑胶质靶向瘤治疗药物的研究与开发提供了新思路与新方法。　　目的：利用条纹斑竹鲨体内可产生IgNAR的特点，通过免疫条纹斑竹鲨CD146抗原表位多肽，取其脾脏和血液，开展转录组测序，比对VNAR数据库，筛选获得差异的目标VNAR序列，并对其重组表达后获得具有高特异性、高活性、且具有良好的肿瘤抑制效果的VNAR。　　方法：用ABCpred，Swiss-Model等生物信息学软件进行CD146抗原表位多肽的筛选，并进行多肽合成作为免疫条纹斑竹鲨的抗原。实验组用10μg抗原表位多肽与弗氏佐剂混合乳化后免疫条纹斑竹鲨。每30天免疫一次，共免疫4个月，期间共定期取血4次，免疫结束后解剖条纹斑竹鲨鱼取出脾脏组织，并取的血液样本进行血细胞、血浆分离，ELISA检测血浆中抗体生成情况及活性。血细胞、脾脏样本进行转录组测序，提取脾脏总RNA，反转录后使用特异性引物扩增VNAR区序列并进行高通量测序建立VNAR文库。对比转录组以及VNAR文库后，筛选获得抗CD146特异性VNAR区序列。　　将获得的抗CD146特异性VNAR区序列进行全基因合成，获得重组质粒pET-32a（+）-VNAR。以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主，开展原核表达，并纯化重组VNAR。ELISA检测重组VNAR的抗原结合特异性及活性。以A172胶质母细胞瘤细胞系为研究对象，进行细胞活性检测、细胞划痕、检测蛋白水平和RNA水平研究重组VNAR的肿瘤抑制活性以及抑制机制。　　结果：1）血浆中成功检测到抗CD146抗体的生成，且随着免疫周期进行活性增加。2）VNAR高通量测序获得702755条序列，与转录组进行比对筛选获得10条预选VNAR序列，均符合VNAR一级序列和二级结构特点。3）重组质粒序列进行诱导表达小试后，均以16℃诱导12h进行放大表达纯化。4）ELISA检测VNAR-CD146-Seq4具有良好的CD146抗原结合活性。5）肿瘤抑制实验证明VNAR-CD146-Seq4能够有效的抑制A172胶质母细胞瘤细胞系的活性，迁移等，并且抑制了CD146，凋亡抑制因子Bcl-2，Mcl-1，Bax的蛋白水平以及MAPK信号通路ERK的磷酸化。　　结论：条纹斑竹鲨免疫CD146抗原表位多肽后产生了针对CD146的特异性免疫应答，产生了抗CD146的IgNAR，通过比对转录组和VNAR高通量测序结果筛选获得预选VNAR序列，在大肠杆菌中重组表达后具有良好的CD146抗原结合特异性，并且其中序列4具有良好的A172胶质母细胞瘤抑制活性。

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