穿山甲在龟龄集中改善衰老性记忆障碍的作用初探

摘要

选题依据：国家中药保密品种、唯一具有升炼工艺的大复方“龟龄集”，具有强身补脑、固肾补气、增进食欲的功效，主要治疗老年肾虚所致的便秘腹泻等老年性疾病和少弱精子症所致男性不育症等男科疾病，课题组前期研究中证明了龟龄集可以改善衰老大鼠的记忆障碍。在药典中公开了龟龄集的20味药材，其中一味中药是“穿山甲”。中药材穿山甲是鲮鲤科动物穿山甲（ManispentadactylaLinnaeus）的鳞甲，性咸，微寒。归肝、胃经，具有活血消癥，通经下乳，消肿排脓，搜风通络功效，用于经闭癥瘕，乳汁不通，痈肿疮毒，风湿痹痛，中风瘫痪，麻木拘挛。但是由于动物资源的缺乏，穿山甲已进入《濒危野生动植物种国际贸易公约》I级保护动物目录，《世界自然保护联盟》将其列为极度濒危级。2020年6月，穿山甲属所有种升为国家一级保护野生动物，2020年版《中国药典》中，穿山甲没有被继续收载，使得穿山甲的药用受到很大的影响。随着穿山甲资源的日渐缺乏，其在中医药如龟龄集中的应用该如何应对呢？当务之急就是要明确龟龄集中穿山甲的作用如何，是否可以简单地去除呢？因此，本研究拟采用正常小鼠与D-gal衰老大鼠模型结合1H-NMR代谢组学研究，探究穿山甲在龟龄集改善衰老性记忆障碍中的作用，阐明其在组方中的必要性，也为穿山甲等濒危动物药材的科学合理使用提供科学依据。　　目的：综合药理学指标和1H-NMR代谢组学对内源性成分全面表征，探究穿山甲在龟龄集中发挥改善衰老性记忆障碍药理作用的贡献及其对内源性代谢物的影响。　　方法：1、采用正常小鼠给予不同药物干预，分为龟龄集组（GLJ，200mg/kg）和阴性龟龄集组（龟龄集去掉穿山甲，Y，200mg/kg），对照组同时给予等体积的1.0%DMSO+2.0%吐温-80+1.5%CMC-Na，灌胃25天，采集全血和小鼠睾丸样本，进行血液细胞分析和睾丸NO含量的测定，观察穿山甲在龟龄集中对正常生理状态下小鼠的血液细胞分析和睾丸NO的影响。　　2、将大鼠随机分为空白对照组（CON）、模型组（MOD）、龟龄集组（GLJ，75mg/kg）、阴性龟龄集组（龟龄集去掉穿山甲，Y，75mg/kg），除空白对照组外其余各组大鼠每天一次皮下注射D-半乳糖（300mg/kg）溶液，连续注射8周，复制衰老大鼠模型。从第5周开始灌胃给药，空白对照组给予溶媒，连续灌胃4周。第8周结束后测定行为学Morris水迷宫实验，取大鼠脑组织做HE染色切片，取血清测定其中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）amp;nbsp;的活性；通过LC-MS定量代谢组学方法检测血清中5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、乙酰胆碱（ACh）等6种神经递质的含量并计算Glu/GABA的比值，研究穿山甲在龟龄集改善大鼠衰老药理作用中的贡献。　　3、应用1H-NMR代谢组学方法，表征大鼠血清代谢物轮廓，根据核磁图谱结合文献指认鉴定化合物并建立数据库，用多元统计方法分析不同给药组的区别，寻找差异代谢物，采用KEGG分析代谢通路，探讨龟龄集中穿山甲对衰老大鼠相关代谢通路的调控作用。　　结果：1、正常小鼠药理实验研究结果：与对照组比较，龟龄集组的红细胞总数升高（P0.05），阴性龟龄集组无明显变化（P0.05），表明穿山甲可能有助于龟龄集提高小鼠的造血功能；白细胞总数和血小板总数无明显变化（P0.05）。龟龄集组与阴性龟龄集组小鼠睾丸的NO结果均高于对照组，但无显著性差异（P0.05），提示龟龄集、与阴性龟龄集均可能对正常小鼠的性功能以及记忆有影响，这与穿山甲活血通络以及龟龄集可以改善记忆和性功能障碍相符合。　　2、穿山甲在龟龄集对大鼠D-gal致衰老性记忆障碍中的药理实验结果　　（1）行为学结果显示，在Morris水迷宫测试中，与对照组相比，模型组大鼠逃逸潜伏期明显增加（P0.01），平台象限滞留时间和穿越平台次数显著减少（P0.05，P0.01），表明模型复制成功，衰老大鼠记忆功能减退。灌胃给予龟龄集后可以明显缩短衰老大鼠逃逸潜伏期（P0.05，P0.01），显著延长平台象限滞留时间（P0.01），并显著增加穿越平台次数（P0.05），而给予除去穿山甲的阴性龟龄集后，虽有回调趋势但无显著性差异（P0.05）。　　（2）病理切片结果：模型组大鼠海马CA区锥体细胞排列混乱、疏松，细胞数量显著减少、间隙增大，出现了明显的海马病理损伤；龟龄集组细胞排列较紧密，较模型组细胞层数增多；阴性龟龄集组CA区锥体细胞排列疏松，细胞数量明显减少、间隙增大、层数明显少于龟龄集组和对照组，与龟龄集组效果有明显差异，说明去掉穿山甲后龟龄集对于海马病理损伤没有明显改善。　　（3）氧化应激结果：与对照组相比，模型组SOD活性显著降低（P0.05）、GSH-Px、MDA水平显著升高（P0.05）。与模型组大鼠相比，龟龄集能使衰老大鼠体内SOD、GSH-Px活性明显回调（P0.05），MDA活性有回调趋势但是无明显差异，说明龟龄集可以起到抗氧化的作用，阴性龟龄集组除SOD外以上指标仍是有回调趋势但无显著性差异，说明去掉穿山甲后龟龄集的抗氧化能力减弱。　　（4）神经递质结果：模型组较对照组单胺类神经递质（NE、DA）、氨基酸类神经递质（Glu、GABA）、胆碱能神经系统（ACh）的含量降低（P0.01，P0.05），Glu/GABA升高（P0.05），说明衰老大鼠的记忆能力减退，龟龄集组在NE、DA、ACh、Glu水平方面明显回调（P0.05），说明龟龄集有改善衰老大鼠记忆的能力。而阴性龟龄集组除NE、Glu（P0.05）有明显回调外，其他神经递质无显著性差异，表明龟龄集去掉穿山甲后改善衰老大鼠记忆的指标明显减弱。可见去掉穿山甲后龟龄集改善衰老引起的记忆障碍的效果明显减弱，提示穿山甲在龟龄集复方中的重要性。　　3、血清代谢组学结果：多元统计分析结果显示对照组、模型组、龟龄集组与阴性龟龄集组四组血清代谢轮廓存在差异。龟龄集组的血清代谢轮廓在对照组与模型组中间，而阴性龟龄集组血清代谢轮廓与模型组一侧。表明龟龄集对衰老模型大鼠的血清代谢轮廓可以起到调节作用，去掉穿山甲后，对衰老模型大鼠的回调作用不明显。血清代谢组学获得的差异代谢物中共鉴定出18种，龟龄集可以回调其中10个代谢物，其中异亮氨酸、3-羟基丁酸、丙酮、琥珀酸、谷氨酰胺、肌酸、胆碱和甘氨酸8个代谢物的含量降低（P0.01，P0.05），氧化三甲胺和β-葡萄糖2个代谢物的水平升高（P0.01，P0.05）。经KEGG通路富集分析，龟龄集可调节甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸与谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等3条代谢途径的紊乱。而去掉穿山甲后没有明显回调作用。　　结论：本研究结果表明穿山甲在龟龄集中显著改善Morris水迷宫行为学指标，有助于修复海马区结构损伤，改善氧化应激与神经递质指标，促进龟龄集通过调节氨基酸代谢通路发挥作用。而龟龄集去除穿山甲后，改善衰老性记忆障碍的作用明显减弱。因此，穿山甲在龟龄集改善衰老引起的记忆障碍作用中发挥了必不可少的作用。

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