基于网络药理学和分子对接探讨连花清瘟干预新型冠状病毒机制

摘要

背景：　　新型冠状病毒疫情自2019年底暴发以来，由于其极具易感性和传播性，在全球呈现蔓延趋势。患者常伴随发热，干咳，乏力等症状，甚至引起肺部炎症和浸润，以及全身炎性细胞因子风暴。因此，COVID-19治疗药物的研究深受国际关注。在尚无有效抗COVID-19药物的情况下，早期中药介入在控制炎症扩散，促进炎症吸收、阻断病程、缩短治疗周期等方面发挥了重要的作用。　　连花清瘟（LHQW）是呼吸系统疾病的一款常见特效中成药，借鉴我国古代名医治疗急性感冒、流感发热等呼吸道外感热病的古方经验，并结合我国现代最新药理学的研究研制而成，目前该中成药已成功被卫生部国家卫生健康委员会列为COVID-19医学观察期人群、临床治疗期轻型及普通型治疗的推荐用药。但是目前连花清瘟治疗COVID-19的具体机制尚不清楚。　　中药方剂具有多种成分、多个靶点、全身免疫调节等功效，网络药理学方法是深入研究中药方剂作用机制的一个独特有效的科学方法，分子对接技术可通过给活性成分与作用靶点的结合情况打分，虚拟筛选出可能有效的中药方剂或者中药材中的活性化合物，通过分子对接技术可以实现快速探索作用靶点，研究其药理活性和作用机制，为中药的现代化研究方法提供有效的技术支持。　　因此，本课题拟利用网络药理学和分子对接等手段从分子水平和蛋白水平探讨连花清瘟干预新型冠状病毒肺炎的机制。　　目的：　　本课题通过网络药理学及分子对接的方法从分子水平和蛋白水平为连花清瘟治疗COVID-19的作用机制展开研究。阐明连花清瘟治疗COVID-19的活性单体化合物及潜在靶点，揭示连花清瘟在抑制炎症应激风暴及对于新冠病毒入侵宿主细胞受体ACE2的调控作用，同时构建SARS-CoV-2入侵宿主细胞过程中ACE2潜在新型共受体的筛选方法，为连花清瘟治疗COVID-19提供理论参考依据。　　内容及结果：　　（1）连花清瘟通过多靶点调控COVID-19介导的细胞因子风暴　　本研究通过网络药理学分析，使用GeneCards数据库对COVID-19的致病靶点进行筛选，结果表明COVID-19的致病核心靶点为TNF，次核心靶点为IL6、GAPDH、TP53、IL10、ALB、IL2、MAPK3。使用TCMSP、UniProt数据库对连花清瘟的主要活性成分及作用靶点进行筛选，结果表明连花清瘟的治疗核心靶点为AKT1，次核心靶点为ALB、MAPK3、IL6、TP53、VEGFA、JUN、EGF。为进一步明确两者的共有靶点，本研究将COVID-19的致病靶点与连花清瘟的作用靶点相互映射，发现两者共有靶点共计45个，其中核心靶点为IL6，次核心靶点为TNF、MAPK8、CXCL8、TP53、MAPK3、IL10、CASP3。并且由于ACE2是COVID-19侵入人体的重要受体，将上述45个COVID-19和连花清瘟的共有靶点与ACE2构建PPI网络，发现其中有8个与ACE2相关的靶点：ALB、NOS3、IL6、CRP、CAT、TNF、CCL2、IL1B。上述靶点多为炎性因子，因此提示连花清瘟可能通过调控上述多种炎症因子介导的细胞因子风暴，从而发挥治疗COVID-19的作用。　　使用R语言对45个共有靶点进行功能注释，GO富集分析显示，最显著的生物学过程为对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide），共有24个靶点参与此过程，其中包含核心靶点IL6以及5个与ACE2相关靶点（NOS3、IL6、TNF、CCL2、IL1B），提示连花清瘟可能通过抑制脂多糖的反应，减少多种炎症因子的释放来缓解LPS造成的肺部损伤。KEGG通路分析显示，最显著的KEGG通路为AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway），共有19个靶点参与此通路，其中包含核心靶点IL6以及5个与ACE2相关靶点（NOS3、IL6、TNF、CCL2、IL1B），提示连花清瘟可能通过调控AGE-RAGE信号通路中的多个靶点的表达，从而减少通路下游炎症因子的释放来缓解组织细胞损伤。　　（2）连花清瘟通过多成分调控核心靶点、次核心靶点及与ACE2相关靶点本研究使用CDOCKER（Discovery Studio）对接程序将相关靶点与连花清瘟中的活性成分进行蛋白-小分子对接，结果显示β-胡萝卜素、异牡荆苷、贯叶金丝桃素等13种活性成分与核心靶点（IL6）；次核心靶点（TNF、MAPK8、CXCL8、TP53、MAPK3、IL10、CASP3）；ACE2；与ACE2相关靶点（ALB、NOS3、IL6、CRP、CAT、TNF、CCL2、IL1B）均显示出较好的结合活性。因此提示连花清瘟可能通过多种活性成分作用于上述靶点发挥调节炎症反应的作用。　　（3）连花清瘟通过多成分调控ACE2与Spike的结合　　本研究使用CDOCKER（Discovery Studio）对接程序将连花清瘟中的活性成分与ACE2-Spike（PDB ID：7KJ2）进行蛋白-小分子对接，结果显示β-胡萝卜素、汉黄芩素、木犀草素、金合欢素、槲皮素、山柰酚均与ACE2-Spike具有较好的结合活性，并且上述6种活性成分可能通过与ACE2和Spike结合的关键氨基酸之间存在相互作用力从而影响ACE2与Spike的结合。　　（4）SARS-CoV-2入侵宿主细胞过程中可能存在ACE2潜在的共受体　　本研究基于核心靶点IL6的生物学特性，采用HADDOCK刚性对接方法将IL6R/IL6/IL6ST与不同构象的S蛋白及S蛋白-ACE2复合体进行蛋白-蛋白对接，从亲和力的角度探究新型候选受体的可能性。结果显示IL6受体复合物中IL6ST与不同构象的S蛋白及S蛋白-ACE2复合体均具有较好的亲和力，且在Spike已经结合ACE2的情况下，IL6ST仍可以结合Spike蛋白的NTD区，因此二者在空间上的竞争关系较弱，有成为ACE2共受体的可能性。　　结论：　　本研究揭示连花清瘟可能主要通过β-胡萝卜素、异牡荆苷、贯叶金丝桃素等活性成分调控核心靶点、次核心靶点、与ACE2相关靶点的表达，并具有直接靶向ACE2-Spike蛋白的能力，从分子水平上初步证实了连花清瘟具有缓解COVID-19炎症反应的作用，同时本研究通过蛋白-蛋白对接提示在新冠病毒入侵宿主细胞的过程中IL6ST有成为ACE2共受体的可能性。

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