MiR--545通过靶向调控Polo样激酶1调控卵巢癌细胞生长和转移的初步研究

摘要

本文从以下三部分进行阐述：　　第一部分卵巢癌中miR-545表达水平和临床意义以及miR-545对卵巢癌细胞生物学行为的影响　　目的:　　分析miR-545在上皮性卵巢癌患者临床标本中的表达情况，分析miR-545在人卵巢癌细胞(Caov3，OV-90，OVCAR3和ES-2)中的表达情况，探讨miR-545与卵巢癌生长和转移的关系。通过在卵巢癌OV-90和ES-2细胞中过表达miR-545，观察miR-545表达对卵巢癌OV-90和ES-2细胞生物学行为（包括细胞增殖、凋亡、侵袭和转移）的影响，探讨miR-545对于卵巢癌OV-90和ES-2细胞中凋亡相关标志物和上皮间充质转换(EMT)相关标志物表达的调节作用。　　方法:　　1.利用RT-qPCR方法，检测60例上皮性卵巢癌患者的肿瘤组织和癌旁正常卵巢组织中miR-545的表达情况，分析miR-545表达水平与上皮性卵巢癌临床特征的相关性;　　2.利用RT-qPCR方法，检测人卵巢癌细胞系Caov3、OV-90、OVCAR3和ES-2和人永生化卵巢上皮细胞系SV40中miR-545的表达情况，分析miR-545与卵巢癌细胞中的表达水平;　　3.对低表达miR-545的人卵巢癌细胞系OV-90和ES-2转染miR-545mimic，利用RT-qPCR方法，检测转染效果;　　4.通过MTT、EdU、细胞集落形成实验检测过度表达miR-545对OV-90和ES-2细胞增殖能力的影响;　　5.通过TUNEL实验检测过度表达miR-545对OV-90和ES-2细胞凋亡水平的影响;　　结果:　　1.与正常癌旁组织相比，miR-545在上皮性卵巢癌组织中表达水平显著降低(P＜0.0001)，miR-545低表达与高的肿瘤FIGO临床分期相关（P＜0.05）;　　2.与永生化人卵巢细胞系SV40细胞相比，Caov3、OV-90、OVCAR3和ES-2细胞中miR-545表达显著降低（P＜0.05）。其中OV-90和ES-2细胞系miR-545的表达水平最低;　　3.MiR-545在人卵巢癌细胞系OV-90和ES-2细胞过表达后，RT-qPCR检测miR-545表达水平显著增加(P=O.0010)，提示转染成功;　　4.MTT、EdU、细胞集落形成实验结果显示，miR-545过表达可显著抑制OV-90和ES-2细胞的增殖能力(MTT实验:P=0.0016，P=0.0011)(EdU实验:P=0.0008，P=0.0011)(细胞集落形成实验:P=0.0016，P=0.0024);　　结论:　　1.MiR-545在上皮性卵巢癌组织中表达水平明显低于正常卵巢组织，与FIGO分期、淋巴结转移显著相关，其低表达与患者的不良预后显著相关，表明miR-545在上皮性卵巢癌发生发展中发挥抑癌基因的作用;　　2.高表达miR-545后，可显著抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭、转移和血管生成能力，促进卵巢癌细胞凋亡，可提高促凋亡蛋白Bax mRNA表达水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA表达水平;miR-545表达上调可能上调E-cadherin的水平，抑制N-cadherin和波形蛋白的表达水平，抑制细胞上皮间充质转换过程。　　第二部分MiR-545靶基因Polo样激酶1的预测和鉴定　　目的:　　通过第一部分研究发现，在上皮性卵巢癌组织及人卵巢癌细胞系中miR-545低表达，提示miR-545可能发挥抑癌基因的作用，参与卵巢癌的发生发展。本部分实验通过调控miR-545、PLK1在卵巢癌细胞中的变化，验证miR-545靶向结合PLK1基因的可能性。　　方法:　　1.用Starbase数据库预测miR-545靶基因后，通过文献回顾，选取PLK1作为本实验的研究对象;　　2.在临床收集的60例上皮性卵巢癌组织和癌旁正常卵巢组织中，利用免疫组化及RT-qPCR技术，检测PLK1蛋白及mRNA的表达水平;　　3.利用RT-qPCR技术检测PLK1mRNA在人卵巢癌细胞系OV-90、ES-2中的表达情况;　　4.利用转染技术，向人卵巢癌细胞OV-90和ES-2中转染miR-545mimic后，应用RT-qPCR和Western Blot检测PLK1mRNA和蛋白表达变化;　　5.通过双荧光素酶报告实验，对miR-545靶向PLK1的负性调控作用进行验证;　　6.在过表达miR-545的人卵巢癌细胞OV-90和ES-2中转染pEX-1-PLK1，利用RT-qPCR和Western Blot检测PLK1mRNA和蛋白的表达水平;　　7.同时过表达PLK1和miR-545后，应用MTT试验检测卵巢癌细胞的增殖能力的改变，应用Transwell小室实验检测卵巢癌细胞侵袭能力的改变;　　8.数据的统计分析应用Graph Pad Prism8.0，数据应用均数±标准差表示。数据间的比较采用的方法为t检验和单因素方差分析(ANOVA)。变量间的相关性分析采用Pearson''s相关性分析。以α=0.05作为检验水准。　　结果:　　1.免疫组化及RT-qPCR显示，PLK1蛋白及mRNA在上皮性卵巢癌组织中的表达均显著高于癌旁正常卵巢组织（P＜0.05），miR-545与PLK1蛋白及mRNA的表达水平均呈负相关（r=-0.6674，P＜0.0001;r=-0.6044，P＜0.0001）;　　2.RT-qPCR结果显示，与SV40细胞相比，OV-90和ES-2细胞中PLK1高表达(P＜0.05);　　3.MiR-545在OV-90和ES-2细胞中过表达后，可显著抑制PLK1mRNA和蛋白表达水平，提示miR-545可调控PLK1的表达水平(P＜0.05）。　　结论:　　1.PLK1在上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞中高表达，与miR-545表达水平负相关;　　2.MiR-545能够特异性靶向结合PLK1基因，负性调控PLK1mRNA和蛋白的表达，参与卵巢癌的进展。过表达PLK1基因可逆转miR-545对卵巢癌细胞增殖和侵袭的抑制作用。　　第三部分MiR-545对卵巢癌生物学行为影响的体内研究　　目的:　　观察miR-545在体内对PLK1、增殖相关蛋白及血管生成相关因子表达水平的调节作用，进一步研究miR-545在裸鼠体内对卵巢癌移植瘤生长和转移的影响。　　方法:　　1.将miR-545稳定表达的OV-90和ES-2细胞和转染空病毒载体的OV-90和ES-2细胞分别接种于裸鼠皮下，观察miR-545对卵巢癌生物学行为的体内影响;　　2.观察并记录裸鼠肿瘤体积，观察miR-545稳定表达的OV-90和ES-2组和对照的OV-90和ES-2组裸鼠肿瘤体积的变化，绘制肿瘤生长曲线;　　3.免疫组化技术检测四组裸鼠肿瘤组织中的PLK1、VEGFA、Ki67的表达;　　4.将miR-545稳定表达的OV-90、ES-2细胞和转染空病毒载体的OV-90和ES-2细胞经尾静脉注射入裸鼠体内，观察miR-545对卵巢癌细胞肺部转移能力的影响;　　5.统计学分析利用GraphPad Prism8.0进行。数据应用均数±标准差表示。数据间的比较采用的方法为t检验和单因素方差分析(ANOVA)。所有实验结果均以α=0.05作为检验水准。　　结果:　　1.过表达miR-545后，裸鼠移植瘤的重量和体积均显著降低(P＜0.05)，肺部转移病灶显著减小(P=0.0003，P=0.0005);　　2.免疫组化结果显示，稳定转染miR-545后异种移植瘤组织中PLK1的表达水平显著降低，肿瘤增殖标志物Ki67、血管生成因子VEGFA的表达水平均显著降低（P＜0.05）。　　结论:　　1.过表达miR-545后卵巢癌细胞在体内增殖速度显著减慢，经血肺部转移能力显著减弱;　　2.MiR-545可调控PLK1蛋白表达水平，抑制卵巢癌细胞在裸鼠生长和转移能力。　　全文结论：　　1.上皮性卵巢癌组织中miR-545的表达明显降低，其低表达与FIGO临床分期、淋巴结转移显著相关，与患者的不良预后显著相关。在卵巢癌细胞中，miR-545显著抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移及血管生成能力，促进卵巢癌细胞凋亡。因而miR-545在卵巢癌的生长和转移过程中起到抑癌基因作用;　　2.PLK1在上皮性卵巢癌组织中高表达，其表达水平与miR-545的表达水平负相关。miR-545能够特异性的结合PLK1的3''UTR区，通过负性调节PLK1mRNA和蛋白的表达，参与卵巢癌的进展;　　3.MiR-545在裸鼠体内可抑制卵巢癌细胞生长和转移能力，在卵巢癌进展中发挥重要作用。

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