基于TSPO PET的多模态观测系统探索Maresin-1改善LPS诱导抑郁症状的研究

摘要

第一部分LPS诱导的抑郁症模型小鼠的多时点行为学研究　　目的：观察在啮齿动物模型中，腹腔注射脂多糖（LPS）可导致炎症性抑郁症状的动态变化。既往研究显示胶质细胞在小鼠单次腹膜内给予低剂量LPS后6小时被激活，并且激活持续至少3-7天，以上情况正好与抑郁样行为同时出现，但却鲜有研究解释两者的关系。故本研究使用LPS的外周给药导致的短暂脓毒血症诱导的时间依赖性抑郁症状，观察抑郁样行为的动态变化和促炎细胞因子和炎症小体的表达，包括白细胞介素-1β（IL-1β）、NLRP3小体(NLRP3-Caspase-1-ACS)。　　方法：从重庆医科大学（中国重庆）获得C57BL/6J小鼠（10-12周龄，18-23g）。在为期两周的适应期之后，将小鼠随机分为载体Control组（n=25）和LPS（大肠杆菌，血清型055：B5，Sigma-AldrichChemical，St.Louis，USA）模型组（n=70）。模型组中的小鼠被细分为LPS-24h组和LPS-72h小鼠组。LPS模型小鼠腹腔内（ip.）注射LPS（PBS中为1mg/kg），而载体Control组注射等效体积的PBS（10mL/kg）。在注射后24小时，Control小鼠和LPS-24h组中的小鼠进行了行为测试，包括尾部悬挂测试（TST），旷场测试（OFT）和糖水偏好测试（SPT）。然后，每组随机抽取8-10只小鼠被安乐死以收集脑组织样本。在注射后72小时，对LPS-72h组小鼠进行以上行为测试。　　结果：　　（1）糖水偏好实验结果显示：LPS-24h组小鼠SPT中糖水偏好百分比减少，较Control组有显著意义（P0.0001）。然而，这些影响在LPS注射后72小时在很大程度上被逆转，相对于在24小时时间点观察到的糖水偏好显著增加，LPS-72h与Control组中观察到的水平没有实质性区别（P=0.736）。　　（2）悬尾实验结果显示：LPS腹腔注射后24小时，我们发现LPS-24组小鼠在悬尾实验中的不动时间显著性长于Control组（P0.0001）；而LPS-72h组小鼠的TST中的不动时间显著减少到与Control组（P=0.523）无差别的水平。　　（3）旷场实验结果显示：LPS腹腔注射后24小时，LPS-24组小鼠在旷场实验中总移动距离和站立行为均显著少于Control组（P0.01）；在注射后72小时对小鼠进行的OFT分析显示，与LPS-24h小鼠相比，总移动距离增加，站立行为更多。然而，相对于Control组，LPS-72小鼠行进的总距离仍然减少（P0.05）。　　（4）体外海马组织炎性因子和炎症小体检测结果：在mRNA水平上，LPS注射后24小时海马IL-1β表达相对于Control小鼠显著增加（P0.01）。NLRP3炎症小体成分NLRP3（P0.001），Caspase-1（P0.01），ASC（P0.01）的海马mRNA水平在LPS注射后24小时相对于Control小鼠显著增加。　　结论：　　（1）LPS诱导急性抑郁和焦虑行为在LPS注射后24小时后出现，抑郁行为和焦虑行为绝大部分在72小时缓解，恢复到正常水平。以上行为和外周急性感染存在时间依赖关系，呈现动态改变的趋势。　　（2）LPS腹腔注射后导致全身炎症反应，交互到中枢海马中，引起炎症因子，炎症小体激活，IL-1β-NLRP3-Caspase-1-ASC通路激活产生神经炎症导致抑郁样行为的产生。　　第二部分体内多时点全脑TSPOPET扫描结合体外海马免疫荧光定位检测对LPS诱导抑郁症模型的多模态观察研究　　目的：小胶质细胞的活化可能参与了抑郁症状的发生，神经元凋亡和炎症细胞因子产生有关。目前使用第二代易位蛋白（TSPO）配体的正电子发射断层扫描（PET）[18F]DPA-714可以直接评估体内的小胶质细胞活化情况。相对于其他TSPO的放射性配体，[18F]DPA-714在中枢内表现出更长的同位素半衰期、更低的非特异性结合、更高的亲和力和优越的生物利用度。在本研究中，我们希望建立一种多模态纵向观测方法来监测LPS诱导的小鼠模型系统中小胶质细胞的活化过程。通过体内PET-CT扫描和体外海马小胶质细胞标志物Iba-1、TSPO的表达和定位，来监测小鼠神经炎症随时间的动态变化。评估了抑郁焦虑行为和小胶质细胞活化之间关联，以阐明这两组变量之间的相关性。　　方法：第一部分Control、LPS-24h和，LPS-72h每组中，随机抽取4-6只小鼠安乐死后，收集脑组织样本进行免疫荧光染色。PET-CT扫描中，我们使用了随机抽取的9只雄性小鼠进行，这些小鼠在LPS注射前24小时（基线），LPS注射后24小时（LPS-24h）和LPS注射后72小时（LPS-72h）进行扫描。尽量在同一时间扫描同一只小鼠。PET数据由PMOD3.8重建分析。　　结果：　　（1）[18F]DPA-714PETCT成像分析。　　我们采用PET成像方法来观察LPS模型小鼠中TSPO特异性配体[18F]DPA-714在不同时间（基线，注射后24小时，注射后72小时）的动态变化，以此系统作为研究手段来动态纵向评估小胶质细胞的激活。SUV值（g/mL）用于表示TSPO特异性配体[18F]DPA-714在整个大脑和特定感兴趣区域（包括皮层，海马体和杏仁核）中的摄取值，SUV值越高，就代表着TSPO水平越高，意味着小胶质细胞激活越多。定量分析显示，在LPS注射后24小时，全脑、皮层、海马体、杏仁核中的[18F]DPA-714信号明显增加，而这些增高的改变在LPS注射后72小时返回到基线水平。基线和注射后24小时的SUV如下：皮层（0.11±0.010vs.0.16±0.011g/ml，P=0.0029），海马体（0.020±0.003vs.0.032±0.003g/ml，P=0.008），全脑（0.42±0.028vs.0.62±0.032g/ml，P=0.0002）和杏仁核（0.0135±0.003vs.0.0173±0.002g/ml，P=0.015）。LPS注射后24h和注射后72h的SUV如下：皮质（0.16±0.011vs.0.13±0.007g/ml，P=0.025），海马体（0.032±0.003vs.0.020±0.002g/ml，P=0.007），全脑（0.62±0.032vs.0.46±0.024g/ml，P=0.0027）和杏仁核（0.0173±0.002vs.0.0152±0.002g/ml，P=0.384）。LPS-72h和基线的SUV之间没有实质性差异：皮质（0.13±0.007与0.11±0.010g/ml，P=0.64），海马体（0.020±0.002vs.0.020±0.003g/ml，P=0.99），全脑（0.46±0.027vs.0.42±0.028g/ml，P=0.53）和杏仁核（0.0152±0.002vs0.0135±0.003g/ml，P=0.232）。　　（2）LPS暴露增加小胶质细胞标志物的表达　　我们采用海马切片的免疫荧光双重染色定位法检测海马区内TSPO和Iba-1或GFAP的表达和定位，以确定TSPO是否主要由（Iba-1+）小胶质细胞表达还是由（GFAP+）反应性神经胶质细胞表达。定量分析显示，相对于Control组海马脑切片，在LPS注射后24小时后收集的小鼠样本表现出Iba-1+活化小胶质细胞数目增加（P0.01），共标TSPO+/Iba-1+细胞数量增加（P0.01），海马体细胞总数增加（P0.05）。相对于LPS-24h小鼠，LPS-72h小鼠海马体中活化的小胶质细胞数量减少（P0.05），双重免疫荧光共定位得TSPO+/Iba-1+阳性的细胞减少（P0.05）并且海马总细胞数减少（P0.05）。在比较来自Control组和LPS-72h小鼠的样品时，未观察到这些变量的差异P0.05）。　　（3）LPS外周暴露改变了海马小胶质细胞的形态学　　用ImageJ分析海马荧光染色切片中小胶质细胞的形态，可以观察到Control组中以静息的小胶质细胞为主，其具有较小的细胞体和较长的细胞分枝。经过LPS刺激后，小胶质细胞被激活，表现出变形杆菌形状，其为细胞体增大，分枝缩短。我们通过方差分析研究不同组间的海马组织切片的中小胶质细胞的形态学数据，在分支终点分析中观察到，LPS-24h和LPS-72h组分枝终点相对于Control组小鼠显著减少（P0.0001,P0.01）。在细胞胞体面积的比较研究中，Control组小胶质细胞的胞体的平均面积为640个体素，明显小于LPS-24h组的胞体（1448个体素）（P0.05）和LPS-72h组的胞体（1809体素）（P0.05）。这些单细胞描述性研究和海马区域的多细胞定量分析都表明，LPS外周注射后海马小胶质细胞被激活。　　结论：　　（1）TSPOPET-CT研究显示，[18F]DPA-714PET在LPS诱导的抑郁症小鼠模型中的摄取值SUV呈现先增高后减低的动态变化。我们观测到在LPS注射后24小时，小鼠全脑、海马体、皮层、杏仁核中[18F]DPA-714摄取值增加，以上增加在LPS注射后72小时基本上恢复到基线水平。　　（2）体内PET成像数据分析以及体外海马组织切片的Iba-1和TSPO染色定位分析使我们能够得出结论，活化的小胶质细胞与该模型系统中增强的[18F]DPA-714摄取具有显著的相关性。[18F]DPA-714信号能非常稳定的反应中枢小胶质细胞激活的定位和定量情况。　　（3）再次验证了外周炎症对中枢小胶质细胞具有激活的作用。通过小胶质细胞形态学分析，我们发现在LPS注射后72小时后，脑部海马区域的小胶质细胞依然存在激活的状态。　　第三部分基于多模态观测系统探索炎症消散物质Maresin-1改善抑郁症状的研究　　目的：假设外周感染启动了炎症程序，产生了IL-1β通过与中枢的免疫应答，活化小胶质细胞M1型，使其分泌促炎因子和自由基，对神经元造成损伤。损伤的神经元可以激活更多的NLRP3小体，进一步活化更多的小胶质细胞，加重炎症。以上炎症恶性循环和炎症消散过程异常有关，我们推测炎症消散物质，MaR1（Maresin-1）可以在LPS诱导的鼠类模型中通过降低炎症因子和炎症小体的激活，同时调节小胶质细胞的活化来改善中枢炎症，从而改善抑郁症状。　　方法：8-10周大雄性C57BL/6J小鼠分组饲养，并保持在标准的饲养条件下（上午7点至下午7点开灯；室温22±2℃）。在适应新环境2周后，将小鼠随机分为健康Control组（33只），LPS+NS组（35只），LPS+MaR1组（35只）。Control组小鼠以10mL/kg体重注射进行腹膜内（ip.）注射生理盐水。LPS组小鼠腹腔注射（ip.）细菌抗原LPS，剂量为1mg/kg体重。同时，对MaR1+LPS组小鼠进行MaR1(5ug/kg)腹腔注射和LPS（1mg/kg）。MaR1和LPS均在生理盐水中以10mL/kg体重的体积制备。对三组小鼠进行注射后24小时的行为学分析，行为学后随机牺牲4只小鼠取出脑部进行炎症因子、炎症小体、焦亡蛋白等蛋白和mRNA和蛋白水平的检测；透明色甲醛灌注取脑（每组随机抽取4只小鼠），固定切片后，进行小胶质细胞激活标志物Iba-1，星状细胞激活标记物GFAP，以及TSPO的免疫荧光染色定量定位分析。对三组小鼠进行每组随机抽取4只接受PET-CT扫描，取得全脑和敏感脑区的TSPOPET扫描研究数据。　　结果：　　（1）MaR1干预部分逆转LPS导致的抑郁症状。小鼠在腹膜内注射LPS（1mg/kg）24小时后发生抑郁焦虑行为。以上行为由TST（尾部悬架测试）和SPT（糖水偏好测试），焦虑行为由OFT（旷场测试）确定。与Control组相比，LPS组小鼠通过增加TST中的不动时间(P0.0001)，并在OFT中减少总距离（P0.0001）表现出抑郁和焦虑行为。LPS模型中的小鼠也显示出SPT实验中糖水偏好的显著减少（P0.0001）。这些结果表明，腹腔内注射LPS（1mg/kg）后24小时成功诱导小鼠抑郁症状改变。然而，和LPS模型组比较，MaR1治疗组显著改善了TST的不动时间（P0.01）和OFT的总距离（P0.01），但糖水偏好百分比下降没有得到缓解。　　（2）MaR1干预部分降低了由LPS诱导的[18F]DPA-714中枢摄取。LPS腹膜内注射24小时后小鼠全脑（P0.0001）和部分脑区如海马体（P0.01）、杏仁核（P0.01）、下丘脑（P0.01）等中[18F]DPA-714的积累量大于Control组。MaR1干预组的小鼠海马、下丘脑、杏仁核中的摄取值显著低于LPS组（P0.05）。　　（3）MaR1干预降低了小胶质细胞标记物Iba-1+表达的数量和TSPO荧光强度。LPS诱导后，Iba-1+，TSPO+平均荧光强均较正常Control组显著增高（P0.0001），MaR1的干预降低了LPS导致以上荧光强度表达（P0.05）。进一步对海马结构进行细致的定量分析，计数三组中海马亚结构区Iba-1+细胞数目，发现在CA1+CA2区域中LPS组Iba-1+细胞总数较其他两组均有所增加（P0.05，P0.01），而正常Control组和MaR1组两组在此结构差异无统计学意义（P0.05）。采用双重染色方法检测海马区内TSPO和Iba-1的表达，以确定TSPO是否主要由活化的小胶质细胞表达，皮尔森相关系数得出TSPO+和Iba-1+信号相关达到60%左右，而TSPO+和GFAP+信号的相关在(0-37%)。结果进一步证实了[18F]DPA-714信号与小胶质细胞活化之间的密切相关性。　　（4）MaR1干预降低小胶质细胞的活化，减少了IL-1β-NLRP3炎症通路的激活。我们发现MaR1干预组小胶质细胞较正常Control组小胶质细胞的胞体面积和分枝体积未见明显差异（P0.05），比LPS模型组小胶质细胞的胞体面积明显减少（P0.001），分枝变细（P0.05）。说明MaR1干预组的小胶质细胞更加接近Control组中的静息状态。在海马区域炎症因子和炎症小体的分析中，我们发现MaR1干预组中IL-1β，NLRP3的mRNA表达水平较LPS模型组存在一定程度的下降（P0.0001，P0.01），MaR1干预组和正常Control组比较，IL-1β、NLRP3依然存在增加（P0.001，P0.01）。随后的蛋白质水平分析中，MaR1干预组小鼠海马体中IL-1β、NLRP3、ASC检测水平存在较LPS组下降的趋势，但未检出差异（P0.05）。Caspase-1蛋白表达水平在组间存在差异，即LPS组较Control组增高（P0.05），MaR1干预组较LPS模型组下降（P0.05），MaR1组较Control组没有差异（P0.05）。焦亡蛋白GSDMD在LPS腹腔注射后，显示出增高的趋势，虽然未检测出和Control组及MaR1干预组的差异（P0.05）。但MaR1干预后GSDMD水平显著少于LPS模型组（P0.01），这说明了MaR1可能降低海马区细胞的焦亡。　　（1）MaR1腹腔注射部分改善了LPS诱导的急性抑郁症状。　　（2）MaR1可能通过减少海马区域IL-1β、NLRP3小体的激活，从而抑制了海马区域的神经炎症和细胞焦亡，起到抗抑郁的作用。　　（3）小胶质形态学分析显示，MaR1能够通过抑制小胶质细胞激活来维持大脑中小胶质细胞的稳态，起到抗抑郁的作用。　　（4）PET-CT研究证实了MaR1降低了全脑和部分脑区如海马，杏仁核、下丘脑等抑郁关键脑区的[18F]DPA-714摄取值，意味着脑区更少的小胶质细胞的激活，在体内实验中证实了MaR1的抗炎抗抑郁作用。

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