糖酵解在高脂饮食诱导的肥胖早孕小鼠子宫内膜蜕膜化损伤中的作用研究

摘要

目的：　　随着社会发展进步，生活质量提高，肥胖人口数量飞速上升。肥胖作为常见的慢性疾病，其引起的内分泌紊乱对妇女妊娠影响受到了广泛关注。大量研究和临床数据显示，肥胖是最常见的妊娠妇女内分泌失调的诱因，是胰岛素抵抗、妊娠糖尿病、子痫、多囊卵巢综合征的独立危险因素，并且随着体重质量指数升高，女性生育力呈下降趋势。众所周知，成功的妊娠不仅需要健康的胚胎，更需要适宜胚胎生长发育的环境。研究发现肥胖可能抑制子宫内膜蜕膜化，导致胚胎着床能力下降。然而，目前有关肥胖损害子宫内膜蜕膜化的研究尚处于起步阶段，相关的机制研究有待进一步深入。此外，文章报道在胚胎着床期间，子宫内膜的葡萄糖摄入量与乳酸生成量明显升高，糖酵解关键酶表达增强，提示糖酵解可能参与子宫内膜蜕膜化过程；并且肥胖患者常常患有一系列诸如糖尿病，胰高血糖症等因糖酵解紊乱而发生的疾病，提示我们糖酵解可能在肥胖引起的子宫内膜蜕膜化损伤中发挥作用。鉴于此，本研究通过动物和细胞模型进行一系列试验，探讨高脂饮食引起的母体孕前肥胖是否会损伤子宫内膜蜕膜化过程，并进一步从糖酵解角度探究其可能机制。　　方法：　　1构建高脂饮食诱导的肥胖早孕小鼠模型：4周龄C57BL/6J雌鼠，普通饲料适应性喂食一周，随机分组并饲喂高脂(60%kcal)、对照(10%kcal)饲料12周后，与正常育龄雄性小鼠合笼交配；收集孕鼠妊娠第七天子宫组织，称量小鼠体重与子宫旁脂肪重量，测量小鼠体长体宽，甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法检测小鼠空腹血清甘油三酯与总胆固醇水平。　　2高脂饮食诱导的肥胖早孕小鼠子宫内膜蜕膜化检测：统计小鼠着床胚胎数量并计算胚胎着床处蜕膜鼓包面积，MASSON染色观察子宫内膜基质细胞转化情况，HE染色观察子宫内膜显微形态，免疫组织化学法染色观察子宫内膜中蜕膜化标志物BMP2表达情况，Westernblot检测子宫内膜中蜕膜化标志物BMP2等表达水平。　　3高脂饮食诱导的肥胖早孕小鼠子宫内膜糖酵解检测：PET-CT检测小鼠子宫糖酵解情况，免疫组织化学法观察子宫内膜中糖酵解关键酶PKM2表达情况，Westernblot检测子宫内膜中糖酵解关键酶HK2等表达水平。　　4高脂处理的子宫内膜基质细胞蜕膜化、糖酵解检测：分离原代小鼠子宫内膜基质细胞，通过雌二醇、孕酮诱导蜕膜化，油酸和棕榈酸进行高脂处理，BODIPY染色观察细胞脂滴累积情况，鬼笔环肽染色观察细胞骨架形态，实时荧光定量PCR检测蜕膜化基因BMP2、dtprp与糖酵解基因HK2、PKM2表达水平，Westernblot检测蜕膜化蛋白COX2、HOXA10与糖酵解蛋白HK2、PKM2表达水平。　　5糖酵解干预对高脂处理的子宫内膜基质细胞蜕膜化影响：在高脂处理的基质细胞诱导蜕膜化的基础上，加入2-DG抑制糖酵解或Pioglitazone促进糖酵解。Westernblot检测糖酵解蛋白HK2等表达水平，细胞能量代谢仪检测基础糖酵解水平、最大糖酵解能力。鬼笔环肽染色观察细胞骨架形态。　　结果：　　1高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型构建成功：高脂组小鼠体型、体宽较对照组明显增大，体重显著增加，子宫旁脂肪重量，空腹血清甘油三酯、总胆固醇水平均显著升高。　　2高脂饮食诱导的肥胖早孕小鼠子宫内膜蜕膜化受损：高脂组小鼠着床胚胎数量、着床胚胎处蜕膜鼓包面积以及其与子宫面积比值，较对照组显著下降；MASSON染色发现高脂组小鼠子宫内膜中有更多的胶原纤维和更少的肌纤维；HE染色发现高脂组小鼠子宫内膜蜕膜细胞形态异常，蜕膜区面积减小；免疫组织化学与Westernblot结果均显示高脂组小鼠子宫内膜中蜕膜化标志蛋白BMP2等表达水平较对照组显著降低。　　3高脂饮食诱导的肥胖早孕小鼠子宫内膜糖酵解受损：PET-CT检测发现高脂组小鼠子宫糖酵解异常；免疫组织化学与Westernblot结果显示高脂组小鼠子宫内膜中糖酵解标志蛋白表达水平较对照组显著降低。　　4高脂损害小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化与糖酵解：BODIPY染色发现高脂处理后，细胞脂滴累积显著增多；鬼笔环肽染色发现在高脂处理下，诱导蜕膜化的基质细胞骨架形态呈细小梭形，细胞核较对照组也更小；实时荧光定量PCR、Westernblot结果同样显示在高脂处理后，诱导蜕膜化的基质细胞中蜕膜化与糖酵解标志基因、蛋白的表达水平显著降低。　　5糖酵解参与肥胖引起的子宫内膜蜕膜化损伤过程：Westernblot结果显示在高脂处理的基质细胞诱导蜕膜化的基础上，2-DG的加入，使得糖酵解相关蛋白表达水平较高脂单独处理进一步下降，表明糖酵解抑制成功；而Pioglitazone处理后，糖酵解相关蛋白表达水平较高脂单独处理有所上升，表明糖酵解激动成功。细胞能量代谢检测发现高脂处理的基质细胞，诱导蜕膜化后，其糖酵解基础能力、最大糖酵解能力显著下降。鬼笔环肽染色观察发现高脂处理的基质细胞诱导蜕膜化后，加入糖酵解抑制剂2-DG，细胞形态进一步缩小，呈细长梭状；而加入糖酵解激动剂Pioglitazone后，细胞形态较为饱和。　　结论:　　糖酵解在肥胖引起的子宫内膜蜕膜化损伤中发挥重要作用。

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