Agrin通过调控Hippo-Yap信号通路在角膜损伤后修复中的作用研究

摘要

背景及目的：严重的化学伤、热烧伤，紫外线照射，Stevens-Johnson综合征，天疱疮及类天疱疮等一系列眼部病变，均可导致角膜缘干细胞功能障碍。严重的角膜缘干细胞功能障碍可以继发角膜上皮持续缺损、角膜溶解、感染，引起角膜结膜化、假性胬肉、角膜新生血管形成、慢性炎症反应，最终导致角膜白斑、角膜盲，不但影响患者生活质量，也给家庭和社会带来了沉重的负担。如何在损伤早期，调动自身角膜缘干细胞增殖、促进角膜上皮修复，成为了控制此类病变发展的重要研究方向。近年来，Hippo-Yap信号通路已被证实在调控组织分化、器官形成，干细胞增殖和凋亡方面起到了举足轻重的作用。Agrin作为一种细胞基质外蛋白，是调控Hippo-Yap信号通路的重要分子。本实验旨在探究Agrin促进角膜缘干细胞增殖及角膜上皮损伤修复的作用及其可能机制。　　方法：1、组织块法提取并培养小鼠原代角膜缘干细胞，分别向各组给予不同处理（SHEM、SHEM+10ng/ml Agrin、SHEM+100ng/ml Agrin），光镜下观察各组组织块周边细胞形态、爬出面积及细胞密度，比较各组间差异；2、CCK-8法检测各组细胞的细胞活力及增殖能力，比较各组间差异；3、免疫荧光法测定各组细胞增殖相关指标（Ki67、pH3）及角膜缘干细胞特异性指标（p63α）,比较各组间细胞增殖能力的差异；4、Western blot检测不同处理组（SHEM、SHEM+10ng/ml Agrin）细胞增殖相关指标（Ki67、pH3）、角膜缘干细胞特异性指标（p63α）、角膜上皮细胞特异性指标（K12）、Hippo-Yap信号通路相关指标（Yap1、pYap1、Cyclin D1）等蛋白的表达水平，比较各组间差异，推测Agrin促进角膜缘干细胞增殖的能力及其可能机制；5、建立小鼠角膜上皮损伤模型，依据不同组别给予相应处理，通过荧光素钠染色、免疫荧光染色等方法，比较各组间差异。　　结果：1、Agrin可加快体外培养的小鼠原代角膜缘干细胞的爬出，提高细胞活力；2、Agrin可促进体外培养的小鼠角膜缘干细胞的增殖；3、Agrin在促进体外培养的小鼠角膜缘干细胞增殖的同时，并未诱导其向分化表型转化；4、Agrin可促进小鼠在体角膜上皮损伤修复；5、Agrin通过抑制Hippo-Yap信号通路中Yap1的磷酸化，达到促进小鼠角膜缘干细胞增殖的作用。　　结论：1.Agrin可促进体外培养的小鼠角膜缘干细胞的增殖，提高细胞活力，但不诱导其向分化表型转化；2.Agrin可加快小鼠在体角膜上皮损伤的修复；3.Agrin通过抑制Hippo-Yap信号通路中重要调控因子Yap1的磷酸化，从而达到促进小鼠角膜缘干细胞增殖的作用。

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