竞争性内源RNA网络调控动脉粥样硬化早期泡沫细胞形成和脂质代谢的研究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分（基础研究）　　背景：动脉粥样硬化的发生以单核细胞分化的巨噬细胞摄取ox-LDL形成泡沫细胞为首要标志。目前很少有研究探讨单核细胞在分化为巨噬细胞之前对动脉粥样硬化斑块形成如泡沫细胞形成、脂质代谢等的直接影响。此外，作为近期研究热点的环状非编码RNA（circRNA）以其独特结构更稳定、特异的存在于生物体内和多种体液中，且其表达和功能多于mRNA或miRNA等线性RNA，目前已发现多种circRNA及调控机制在癌症中的重要作用，但是关于早期动脉粥样硬化的巨噬细胞模型中circRNA的分子变化和参与的机制研究仍然不足。　　目的：本研究旨在探讨动脉粥样硬化早期单核细胞进入内皮下分化为巨噬细胞之前以及巨噬细胞的功能差异，并进一步探讨早期氧化损伤条件下巨噬细胞的RNA分子变化和潜在的调控机制，为早期进行动脉粥样硬化的诊断或靶向干预提供理论依据。　　方法：①中等浓度ox-LDL诱导THP-1单核细胞和巨噬细胞的氧化损伤模拟动脉粥样硬化早期状态，比较两种细胞在泡沫细胞形成（油红O染色）、脂质代谢（细胞内TC、T G含量检测，胆固醇摄入、排出分子表达）和炎症因子分泌的情况；②对上述早期氧化损伤的巨噬细胞进行全转录组测序，对比分析非编码RNA（circRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、miRNA）和靶基因(mRNA)的分子变化和相关的通路，联合分析并选定特异差异表达的竞争性内源RNA（ceRNA）关系网络；③对上述筛选的差异RNA的表达和预测有特异结合关系的ceRNA调控网络在动脉粥样硬化早期损伤细胞模型中的作用进行验证，PCR检测组间明显差异的top3circRNA、miRNA的表达，Western Blot检测差异top3靶基因的蛋白表达，并用siRNA特异干扰选定的hsa_circ_0007514、novel_miR_1597激动剂和hsa_circ_0007514siRNA联合novel_miR_1597阻断剂分别处理ox-LDL诱导的巨噬细胞，分别检测该circRNA、miRNA、特异结合靶蛋白LYZ的表达，并在功能层面观察该ceRNA关系网络对泡沫细胞形成、胆固醇代谢等的影响。　　结果：①对比早期氧化损伤的巨噬细胞，油红O染色显示单核细胞不能直接形成泡沫细胞，且TC和TG细胞内含量极低，在ox-LDL诱导后单核细胞胆固醇摄入分子CD36、SR-A、LOX-1，胆固醇排出分子ABCA1、ABCG1、LXRα的表达以及炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10的分泌没有明显差异。②对比正常组，测序显示早期氧化损伤的巨噬细胞差异表达上调和下调的mRNA437个、miRNA233个、lncRNA323个以及circRNA25个，发现多条差异表达的相关分子功能和通路，差异表达分子的联合分析显示存在多条ceRNA关系网络，包括上调mRNA12个、下调mRNA7个，部分特异结合的上游上调miRNA4个、下调miRNA1个，与miRNA特异结合的lncRNA共11个，上调circRNA3个、下调circRNA3个，筛选出hsa_circ_0007514-novel_miR_1597-LYZ的ceRNA关系网络。③PCR检测模型组hsa_circ_0007514、novel_miR_1597、hsa-miR-885-5p和hsa-miR-3173-5p的表达及WB检测LYZ、SHE、CCDC69的蛋白表达与测序结果相同且有明显差异；分别敲低hsa_circ_0007514表达以及激动novel_miR_1597的模型组细胞novel_miR_1597和下游LYZ的表达分别上调和下调，油红O显示泡沫细胞的形成亦受到影响；此外，同时敲低hsa_circ_0007514并阻断novel_miR_1597的表达，模型组细胞下游靶基因LYZ的蛋白表达重新上调，油红O染色显示泡沫细胞形成增加、细胞内TC和TG的含量显著增加。　　结论：①早期氧化损伤的单核细胞在转化为巨噬细胞前不具备直接形成泡沫细胞、调控胆固醇摄入和排出代谢以及明显的炎症因子分泌的能力；②早期氧化损伤的巨噬细胞具有明显差异表达的非编码RNA和mRNA，其中hsa_circ_0007514-novel_miR_1597-LYZ的ceRNA关系网络在正常组和模型组间差异表达，且具有关联的的调控关系，该ceRNA网络参与调控动脉粥样硬化早期泡沫细胞的形成和脂质代谢。　　第二部分（临床研究）　　背景：动脉粥样硬化的重要使动因素是血脂异常，近期研究表明脂蛋白(a)[Lp(a)]是心血管疾病的危险因素，且其浓度主要与遗传和种族相关，国外存在较多单核苷酸多态性（SNPs）或其基因结构与Lp(a)浓度的研究，而我国汉族普通人群LPA基因SNPs与其浓度关联的研究仍然较少。　　目的：本研究旨在探讨普通人群中LPA基因的部分SNPs及单倍型与Lp(a)浓度的关系，为预测或防治心血管事件发生提供证据支持。　　方法：此部分研究选取2007年-2009年北京苹果园社区人群中检测Lp(a)浓度并进行DNA样本提取的个体共893例，汇总研究对象的基线指标特征，包括性别构成、年龄、BMI、血脂、是否吸烟、有无高血压、糖尿病、冠心病等；根据NCBI及千人基因组计划中汉族人群的SNP数据库，参考欧美人群研究筛选出18个LPA基因的标签及候选SNP位点，采用Hi-SNP结合多重PCR和高通量测序技术进行SNP的基因分型检测；对结果进行质控，并将Lp(a)的浓度以30mg/dL的标准分为正常组和升高组，最后进行一系列SNP位点和单倍型与Lp(a)浓度的关联分析。　　结果：①研究人群遗传稳定符合哈温平衡，Lp(a)＞30mg/dL的人群中男性比例较高但年龄偏低，Lp(a)浓度为（50.97±18.65）mg/dL，同时总胆固醇和LDL-C水平明显高于Lp(a)≤30mg/dL的人群，后者Lp(a)浓度为（10.84±6.87）mg/dL，总人群中高血压的患病比例较高为48.71%；②筛选的7个SNP位点rs6923877、rs7765781、rs73596816、rs7770628、rs6926458、rs10945682、rs41269133的基因型和等位基因频率在两组间有明显差异，其中rs73596816和rs7770628位点与Lp(a)浓度升高显著相关。在这些位点中，本研究首次发现rs41269133位点与Lp(a)浓度相关，rs6926458、rs73596816和rs7770628是我国人群较为特异的Lp(a)关联位点，而rs1321195和rs7761293是欧洲人群中特异的Lp(a)浓度关联位点。③14个位点在三个区块中连锁不平衡分别存在5、6和3种单倍型，区块2中有三种、区块3中的三种单倍型在Lp(a)升高和正常组中存在明显差异，rs41269133相关的三种单倍型均与Lp(a)浓度相关。　　结论：LPA基因的SNPs存在种族差异，研究首次发现位点rs41269133与Lp(a)浓度相关，在7个有意义的SNP位点中rs73596816和rs7770628位点与Lp(a)浓度升高明显相关，以上位点相关的6种单倍型与Lp(a)浓度相关，对心血管疾病可能有一定的指导和预测意义。

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