免疫磁珠-环介导等温扩增法快速检测三种食源性致病菌

摘要

食源性致病菌是造成当今社会食品安全问题的重要因素，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7是食品中常见的三种食源性致病菌，可导致人腹泻和呕吐，严重时甚至可致人死亡。常用食源性致病菌检测技术缺陷是检测周期长，设备和试剂昂贵且操作过程复杂，样品前处理复杂而繁琐。　　免疫磁珠分离(immunomagnetic separation, IMS)可快速分离致病菌，保护分离菌的生物活性，有效消除影响核酸扩增物质，提高检测的灵敏度，过程简单易用，无需昂贵的离心设备，是一种最具潜力浓缩和分离致病菌的前处理方法。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种适合基层检测特定致病菌的分子生物学方法，准确性高，检测时间短，对仪器设备要求低，适合快速检测致病菌。本研究把免疫磁珠富集方法和环介导等温扩增检测技术相结合，建立的致病菌IMS-LAMP快速检测方案，是一种简单，快速，高度特异性的基因检测技术，适用于食品污染领域的测试。研究结果如下：　　1.金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的免疫磁珠富集方法的构建。分别将生物素标记的沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体与链霉亲和素纳米磁珠偶联，1mg纳米磁珠偶联抗体量分别为10μg和6μg。沙门氏菌免疫磁珠、金黄色葡萄球菌免疫磁珠和大肠杆菌O157:H7的免疫磁珠富集条件优化，1mL反应体系中免疫磁珠添加量分别为400μL、300μL和60μL，反应时间分别为45min、30min和30min。三种致病菌的免疫磁珠特异性好，对5种非目标细菌未有捕获，灵敏度高，菌液浓度低至101CFU/mL时仍有捕获。　　2.金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的LAMP检测方法的建立。在LAMP反应液中添加荧光染料，建立实时荧光LAMP法。根据沙门氏菌的invA基因，金黄色葡萄球菌的nuc基因和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的保守序列设计引物，进行引物筛选，选出最佳引物invA-2、nuc-1和rfbE-1。对影响LAMP反应的温度进行优化实验，确定最优反应温度63℃。三种致病菌LAMP反应的特异性好，对5种非目标核酸无扩增反应。阴性重复结果好，在20次的阴性重复测试中均未发生扩增反应。精密度高，对10pg/μL和1pg/μL浓度的目标质粒，LAMP法对沙门氏菌质粒的CV(Coefficient of Variance)值分别为3.58%和3.22%，对金黄色葡萄球菌质粒的CV值分别为3.65%和3.47%，对大肠杆菌O157:H7质粒的CV值分别3.40%和3.28%。灵敏度高，沙门氏菌质粒的灵敏度为1.91×102copies/μL，金黄色葡萄球菌质粒的灵敏度为2.72×102copies/μL，大肠杆菌O157:H7的质粒灵敏度为2.28×102copies/μL，其灵敏度与对照的Real-timePCR检测灵敏度相同。检测不同浓度的纯培养菌液，鼠伤寒沙门氏菌灵敏度为3.0×102CFU/mL，金黄色葡萄球菌灵敏度为1.1×102CFU/mL，大肠杆菌O157:H7灵敏度1.75×103CFU/mL。　　3.金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的IMS-LAMP检测方法的建立。IMS-LAMP法检测不同浓度的纯培养菌液，对鼠伤寒沙门氏菌菌液的最低检测浓度为3.0×102CFU/mL，对金黄色葡萄球菌菌液的最低检测浓度为1.1×102CFU/mL，对大肠杆菌O157:H7灵敏度为1.75×102CFU/mL。IMS-LAMP法与LAMP法检测人工污染牛肉样品，沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的IMS-LAMP法的灵敏度分别为1.2×103CFU/mL和7.0×103CFU/mL，都比LAMP法高10倍。金黄色葡萄球菌的IMS-LAMP法的灵敏度与LAMP法相同，都为4.4×104CFU/mL，但IMS-LAMP法检测4.4×103CFU/mL浓度样品的阳性率为66.67%，LAMP法在相同浓度下未有检出。对于100CFU/mL的低浓度样品进行增菌培养，IMS-LAMP法可比LAMP法提前至少2h检测到扩增曲线。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 三种常见的食源性致病菌简介

1.1.1 沙门氏菌简介

1.1.2 金黄色葡萄球菌简介

1.1.3 大肠杆菌O157:H7简介

1.2 LAMP技术简介

1.2.1 LAMP的扩增原理

1.2.2 LAMP产物的检测方法

1.2.3 LAMP在三种致病菌检测中的应用

1.3 免疫磁珠分离技术

1.3.1 免疫磁珠结构和技术原理

1.3.2 免疫磁珠在三种食源性致病菌检测中的应用

1.4 论文研究意义和研究内容

1.4.1 研究意义

1.4.2 研究内容

第二章 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的免疫磁珠(IMS)富集方法的建立

2.1实验材料与设备

2.1.1 主要实验材料

2.1.2 主要实验设备

2.1.3 实验菌株

2.1.4主要试剂配制

2.2实验方法

2.2.1 菌株活化和培养

2.2.2 试验菌液制备

2.2.3 免疫磁珠捕获率计算公式

2.2.4 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌免疫磁珠的制备

2.2.5 免疫磁珠添加量

2.2.6 免疫磁珠与菌液反应时间

2.2.7 免疫磁珠特异性

2.2.8 免疫磁珠敏感性

2.3实验结果与分析

2.3.1 抗体与纳米磁珠的最佳偶联量

2.3.2 免疫磁珠添加量结果

2.3.3 免疫磁珠与菌液反应时间结果

2.3.4 免疫磁珠的特异性结果

2.3.5 免疫磁珠的敏感性结果

2.4 小结

第三章 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的环介导等温 (LAMP) 检测方法的建立

3.1实验材料与设备

3.1.1 主要实验材料

3.1.2 主要实验设备

3.1.3 实验菌株

3.1.4主要试剂配制

3.2实验方法

3.2.1 菌株活化和培养

3.2.2 DNA提取

3.2.3 靶标基因的查找和引物设计

3.2.4 LAMP反应体系及程序

3.2.5 LAMP引物筛选

3.2.6 LAMP反应体系优化

3.2.7 LAMP反应的特异性实验

3.2.8 LAMP反应和Real-time PCR反应的灵敏度实验

3.2.9 检出限实验

3.2.10 阴性重复和精密度实验

3.2.11 LAMP检测原菌液的灵敏度

3.3实验结果与分析

3.3.1 LAMP引物设计结果

3.3.2 LAMP引物筛选结果

3.3.3体系优化结果

3.3.4 LAMP特异性实验结果

3.3.5 灵敏度实验结果

3.3.6检出限结果

3.3.7 阴性重复实验和精密度验证结果

3.3.8 原菌液灵敏度结果

3.4小结

第四章 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的免疫磁珠-环介导等温扩增 (IMS-LAMP) 检测方法的建立

4.1实验材料与设备

4.1.1 主要实验材料

4.1.2 主要实验设备

4.1.3 实验菌株

4.1.4主要试剂配制

4.2实验方法

4.2.1 人工污染样品中细菌基因组 DNA快速提取

4.2.2 菌株活化和培养

4.2.3 IMS-LAMP法检测步骤

4.2.4 IMS-LAMP检测不同浓度的原菌液

4.2.5 IMS-LAMP 和LAMP检测实际牛肉样品

4.3实验结果与分析

4.3.1 IMS-LAMP法检测原菌液灵敏度

4.3.2 人工污染牛肉样品结果

4.4小结

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

英文标题缩略总表

硕士在读期间发表论文

致谢