CRMP2促进磷酸化的AMPA受体GluA2亚基的转运

摘要

目的：　　探讨CRMP2对磷酸化的AMPA受体GluA2亚基转运的影响。　　方法：　　本次研究我们运用了分子克隆技术、GST-Pulldown实验、Co-IP实验、免疫荧光成像和全细胞膜片钳等实验方法进行研究。首先，我们构建了GluA2S880的磷酸化突变体和野生型GluA2亚基，并检测CRMP2与不同修饰状态GluA2亚基结合的差异；其次，在过表达CRMP2条件下，通过佛波酯(TPA)模拟外源性磷酸化及通过PKCζ模拟内源性磷酸化GluA2S880，观察神经元AMPA受体GluA2亚基膜蛋白表达及突触后电位，分析其I-V曲线；最后，在过表达PKCζ的条件下，我们使用siCRMP2小分子干扰片段干扰CRMP2表达后，观察神经元mEPSCs并分析I-V曲线的斜率，研究CRMP2对磷酸化GluA2亚基转运的影响。　　结果：　　1)在佛波酯(TPA)外源性磷酸化GluA2的条件下，在海马神经元中过表达CRMP2可以促进磷酸化的GluA2的上膜，增强神经元mEPSCs的振幅和频率。　　2)通过GST-Pulldown实验、Co-IP实验、亚细胞共定位实验发现CRMP2与GluA2存在相互作用，这种结合作用与GluA2的修饰状态有关。磷酸化的GluA2(S880D)与CRMP2结合增强，非磷酸化的GluA2(S880A)与CRMP2结合减弱。　　3)在HEK293T细胞和培养的海马神经元细胞中，过表达CRMP2可以促进野生型GluA2的膜表达，并增强神经元mEPSCs的振幅和频率，同时增加I-V曲线的斜率。　　4)在通过PKCζ模拟内源性磷酸化GluA2的条件下，过表达CRMP2促进了神经元GluA2的膜表达丰度，并增强神经元mEPSCs的振幅，其频率未见明显差异，I-V曲线显示实验组斜率增加；在同样条件下，干扰CRMP2表达后，神经元的mEPSCs振幅和频率降低，I-V曲线的斜率减小。　　结论：　　1.CRMP2与GluA2存在蛋白互相作用，GluA2S880位点磷酸化可增强与CRMP2的结合。　　2.CRMP2促进野生型GluA2的膜表达。　　3.CRMP2与磷酸化的GluA2(S880D)结合增强从而促进磷酸化的GluA2重新在膜上表达。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 突触可塑性

1.3 AMPA受体

1.4 GluA2亚基及其磷酸化

1.5 AMPA受体的转运

1.6 CRMP2

1.7 研究的目的和意义

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.3 主要实验试剂、工具及试剂盒

2.1.4 一般试剂的配制

2.1.5主要仪器设备设备

2.2实验方法

2.2.1质粒的构建

2.2.2质粒的中提

2.2.3 GST-CRMP2原核蛋白的表达及纯化

2.2.4 考马斯亮蓝染色

2.2.5 GST-Pull down

2.2.6 Western Blot实验SDS-PAGE凝胶制配

2.2.7 HEK293T细胞培养

2.2.8 海马神经元原代培养

2.2.9 磷酸钙沉淀法细胞转染

2.2.10 GO3000试剂转染HEK293T细胞

2.2.11 CO-IP

2.2.12 细胞免疫荧光染色

2.2.13 电生理全细胞膜片钳

2.3 数据统计与分析

第三章 实验结果

3.1 CRMP2可以促进由TPA诱导的磷酸化的GluA2的上膜

3.2.1 过表达CRMP2增强AMPA受体介导的神经元mEPSC的振幅和频率

3.2.2 过表达CRMP2增强稳定株及海马神经元表面的GluA2亚基的表达

3.3 CRMP2与GluA2存在相互作用

3.4 GluA2 S880位点磷酸化突变增强与CRMP2的结合

3.5 CRMP2促进了由PKCζ诱导的磷酸化GluA2的上膜

3.6 干扰CRMP2表达后，磷酸化的GluA2膜上表达减少，膜电位减弱

第四章 讨论

4.1 CRMP2与GluA2相互作用

4.2 CRMP2对GluA2转运的影响

4.3 CRMP2对PKC介导的磷酸化的GluA2转运的影响

4.4 敲减CRMP2对磷酸化GluA2转运的影响

第五章 结论

参考文献

主要英文缩略词对照表

在校期间发表的论文

致谢