SOS1调节慢性粒细胞白血病(CML)伊马替尼敏感性和不依赖于BCR-ABL1耐药性及其分子机制研究

摘要

研究背景：目前慢性粒细胞白血病(CML，chronic myeloid leukemia)临床治疗主要的难题就是耐药，尤其是不依赖于BCR-ABL1的耐药。前期研究发现SOS1(son of sevenless homolog 1)是miR-181a的靶基因，并且经细胞系及临床病例筛查得出SOS1在CML中表达量较正常细胞/样本高，初步鉴定SOS1在CML中具有癌基因性质，但SOS1在CML中具体的作用机制及其与伊马替尼(imatinib)敏感性/耐药性的关系尚不清楚。　　研究目的：本课题致力于探索癌基因SOS1在CML中与imatinib药物敏感性与不依赖于BCR-ABL1耐药性的关系及其分子机制，为克服不依赖于BCR-ABL1的耐药提供新的潜在治疗靶点。　　研究方法：　　1.脂质体LipofectamineTM2000转染SOS1-siRNA#1/#2/#3到K562/KCL22/BV173细胞；WesternBlot和qPCR验证筛选有效的SOS1-siRNA序列；　　2.利用SOS1质粒构建、嘌呤霉素筛选过表达SOS1蛋白的K562/KCL22细胞；WesternBlot验证细胞内SOS1表达水平；　　3.CCK-8试剂检测SOS1对K562/KCL22细胞活力的影响；　　4.细胞周期检测试剂盒检测靶向抑制SOS1对K562/KCL22细胞周期的影响；　　5.软琼脂克隆形成实验(soft agar assay)检测SOS1对K562/KCL22细胞克隆形成能力的影响；　　6.Balb/c裸鼠皮下成瘤实验检测体内SOS1-siRNA对K562细胞增殖的影响；　　7.CCK-8试剂检测SOS1对K562/KCL22/KU812细胞对imatinib药物敏感性的影响；Softagarassay检测SOS1对K562/KCL22细胞对imatinib药物敏感性的影响；　　8.293T-Flag-SOS1/293T-Flag-empty免疫沉淀(IP)产物，质谱检测并分析鉴定蛋白组分；9.RNA-seq检测与SOS1相互作用基因；qPCR/WesternBlot验证细胞内SOS1与SLC22A4表达变化；　　10.HPLC检测SOS1对K562/KCL22细胞imatinib吸收影响；　　11.不断增加KCL22细胞imatinib培养浓度，构建不依赖于BCR-ABL1耐药细胞株KCL22-IMR；　　12.SOS1/Ras抑制剂BAY-293处理KCL22-IMR，CCK-8检测细胞活力，softagarassay检测细胞克隆形成能力变化；　　13.WesternBlot检测BAY-293处理后KCL22-IMR细胞中SLC22A4蛋白相对表达量变化；　　14.HPLC检测SOS1对KCL22-IMR细胞imatinib吸收影响；　　研究结果：　　1.SOS1-siRNA#3靶向抑制SOS1，降低了K562/KCL22细胞活性和细胞克隆形成能力，增强了细胞对imatinib的药物敏感性；　　2.SOS1过表达的K562/KCL22细胞株，WB验证SOS1表达量明显增多；　　3.过表达SOS1，增强了K562/KCL22细胞克隆形成能力，降低了细胞对imatinib的药物敏感性；　　4.靶向抑制SOS1，K562/KCL22细胞周期抑制在G0/G1期；　　5.Balb/c裸鼠皮下成瘤实验，K562-SOS1-siRNA#3组增殖能力较NC组明显降低；　　6.IP产物的质谱结果显示，与SOS1相互作用的蛋白一共有103个，其中包括SLC22A4，KEGG整合到多条信号通路包括PI3K-AKT信号通路；靶向抑制SOS1抑制了PI3K-AKT信号通路，促使P27增加，细胞周期抑制；　　7.RNA-seq检测表明，靶向抑制SOS1促进了K562/KCL22细胞中SLC22A4的表达；　　8.qPCR/WesternBlot验证了K562/KCL22细胞中靶向抑制SOS1促进SLC22A4表达；　　9.HPLC检测到靶向抑制SOS1促进了K562/KCL22细胞对imatinib的吸收；　　10.构建的imatinib耐药株(KCL22-IMR)，能够耐受高达10μM的imatinib；　　11.SOS1/Ras抑制剂BAY-293，抑制了耐药株细胞活力及克隆形成能力；　　12.BAY-293促进了KCL22-IMR细胞中SLC22A4的表达；促进了KCL22-IMR细胞内imatinib含量；　　研究结论：　　1.SOS1在CML中具有癌基因性质，靶向抑制SOS1有效抑制了CML的恶性进展；　　2.SOS1通过负调控SLC22A4表达，影响CML对imatinib的药物敏感性和耐药性；　　3.BAY-293，可作为潜在治疗不依赖于BCR-ABL1耐药的抑制剂。

目录

声明

前言

1. 慢性粒细胞白血病

1.1 CML致病机理

1.2 BCR-ABL1信号转导

1.3 CML的治疗

2. TKIs耐药

2.1依赖于BCR-ABL1的imatinib耐药

2.2不依赖于BCR-ABL1的imatinib耐药

3. SOS1

4. RNA-seq技术

5. SLC22A4

6. 研究假说与研究思路

7. 技术路线

8. 研究意义及创新之处

9. 实验内容

第一部分SOS1调控CML细胞生长及其分子机制研究

实验材料和方法

1. 实验试剂

2. 随机序列的RNA双链和SOS1-siRNA序列

3. 细胞株

4. 实验动物

5. 主要试剂配制

6. 主要仪器和材料

7. 实验方法

8. 统计学分析

实验结果

1. 验证miR-181a的靶标SOS1

2. Ph+白血病细胞、正常人及CML病人外周血单核细胞中SOS1的相对表达

3. SOS1有效siRNA序列筛选

4. SOS1对CML细胞增殖的影响

5. 质谱检测SOS1相互作用蛋白及相关信号通路

讨论一

第二部分SOS1调节CML细胞Imatinib药物敏感性及其分子机制的研究

实验材料及方法

1. 主要试剂

2. 主要试剂配制

3. 主要仪器

4. 细胞株

5. 实验方法

实验结果

1. 靶向抑制SOS1增强CML细胞对imatinib的药物敏感性

2. SOS1过表达降低CML细胞对imatinib的药物敏感性

3. RNA-seq检测靶向抑制SOS1对K562细胞基因组表达水平的影响

4. HPLC检测SOS1对CML细胞imatinib药物吸收的影响

讨论二

第三部分SOS1调节不依赖于BCR-ABL1的imatinib耐药性研究

实验材料及方法

1. 主要试剂

2. 主要试剂配制

3. 实验方法

实验结果

1. 不依赖于BCR-ABL1激酶的Imatinib耐药株耐药性的验证

2. BAY-293克服不依赖于BCR-ABL1激酶的imatinib耐药

3. BAY-293调控SLC22A4克服不依赖于BCR-ABL1激酶的耐药

4. SOS1在CML中作用机制的总结

讨论三

结论

不足与展望

参考文献

在读期间的科研及学习成果

课题基金来源

致谢