17β-雌二醇对rBMSCs肝祖细胞定向分化及Hedgehog信号通路的调控作用

摘要

目的：　　通过体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stemcells， rBMSCs)，研究17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)对rBMSCs肝祖细胞定向分化能力及分化过程中Hedgehog(Hh)信号通路的调控作用。为今后研究rBMSCs肝向分化机制提供新的理论依据，为临床获得稳定的肝细胞来源提供新方法。　　方法：　　1、rBMSCs的培养及鉴定：运用全骨髓贴壁分离法获得稳定的rBMSCs体外培养体系。通过倒置显微镜观察rBMSCs形态学改变、CCK-8法测定细胞增殖情况并绘制生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期及细胞表面标志物CD29、CD45、CD80、CD90的表达情况、茜素红及油红O染色鉴定rBMSCs多向分化能力。　　2、在浓度为10-6mmol/l的17β-E2干预下将rBMSCs定向诱导分化成肝祖细胞，实验分为4组：α-MEM培养基组(Control组)、肝向分化诱导培养基组(经典组)、17β-E2+α-MEM培养基组(E2组)、17β-E2+肝向分化诱导培养基组(经典+E2组)，每2d全量换液，倒置显微镜观察第6d、10d各组rBMSCs形态学变化，用免疫荧光技术定性检测各组AFP在细胞中的定位，化学发光免疫法测定各组AFP表达量。　　3、Hedgehog相关信号蛋白测定：采用Westernblot法分别检测第6d、10d各组rBMSCsHedgehog相关信号蛋白(Ptch-1、Gli-1)表达。　　结果：　　1、倒置显微镜观察rBMSCs呈贴壁生长，绝大多数细胞呈漩涡状、梭形生长，各细胞集落之间可有重叠，细胞生长状况良好，生长曲线为“S”形增长，G0/G1期为90.5%，表面抗原标志物CD29、CD90的阳性率分别为99.85%、98.36%；CD45、CD80的阳性率分别为0.71%、5.16%，茜素红染色与油红O染色结果均为阳性，符合rBMSCs生物学特征。　　2、在rBMSCs向肝祖细胞诱导培养的第6d，经典组与经典+E2组的细胞贴壁能力减弱，形态逐渐由梭形向多边形、类圆形改变，至第10d，大多数细胞形态与肝祖细胞相似，呈类圆形或肝板样排列。而Control组与E2组细胞形态无明显变化。　　3、免疫荧光法检测第6d各组AFP表达情况：经典组与经典+E2组的AFP荧光染色均为阳性，表达于胞浆，而Control组与E2组AFP荧光染色为阴性。　　4、化学发光免疫法测定第6、10d各组AFP含量。第6d：Control组与E2组AFP含量均为0ng/ml；经典组与Control组、E2组相比较，AFP含量均明显增高(P值均为0.001)；经典+E2组与Control组、E2组相比较，AFP含量均显著增高(P值均为0.001)；经典+E2组与经典组相比较，AFP含量明显增高(P=0.036)。第10d：Control组与E2组AFP含量均为0ng/ml；经典组与Control组、E2组相比较，AFP含量均明显增高(P值均为0.001)；经典+E2组与Control组、E2组相比较，AFP含量均显著增高(P值均为0.001)；经典+E2组与经典组相比较，AFP含量明显增高(P=0.028)。　　5、WesternBlot法分别检测第6、10d各组Ptch-1和Gli-1的蛋白表达量。第6d：经典+E2组Ptch-1表达量显著高于Control组、经典组及E2组(P值分别为0.025、0.037、0.023)；Control组、经典组及E2组Ptch-1表达量差异均无显著性(P＞0.05)；经典+E2组Gli-1表达量显著高于Control组、经典组及E2组(P值分别为0.021、0.037、0.009)；Control组与经典组Gli-1表达量差异无显著性(P＞0.05)。第10d：经典+E2组Ptch-1表达量显著高于Control组、经典组及E2组(P值分别为0.009、0.022、0.007)；Control组、经典组及E2组Ptch-1表达量差异均无显著性(P＞0.05)；经典+E2组Gli-1表达量显著高于Control组及E2组(P值分别为0.004、0.008)；经典组Gli-1表达量显著高于Control组及E2组(P值分别为0.066、0.012)；经典+E2组与经典组Gli-1表达量差异无显著性(P＞0.05)。　　结论：　　1、全骨髓贴壁分离法可建立实验所需的稳定rBMSCs体外培养体系；　　2、17β-E2可显著提高rBMSCs肝祖定向的分化率；　　3、17β-E2提高rBMSCs肝祖定向分化率可能与调控Hedgehog信号通路有关。

目录

声明

前言

研究背景

1.1BMSCs的特性及培养

1.2BMSCs肝向分化机制

1.3 BMSCs与肝硬化

1.4雌激素与肝硬化

1.5Hedgehog信号通路的组成

1.6雌激素、Hedgehog信号通路与BMSCs肝向分化

2实验部分 rBMSCs的培养与鉴定

2.1实验目的

2.2实验材料

2.3实验方法

2.3.1实验试剂及设备

2.3.2 rBMSCs的培养及传代

2.3.3 CCK-8法检测细胞活性并绘制生长曲线

2.3.4 rBMSCs细胞周期测定

2.3.5 rBMSCs表面标志物的鉴定

2.3.6 rBMSCs骨向分化能力鉴定

2.3.7 rBMSCs脂向分化能力的鉴定

2.4实验结果

2.4.1rBMSCs形态学观察

2.4.2rBMSCs生长曲线测定

2.4.3 rBMSCs细胞周期的测定

2.4.4 rBMSCs表面标志物的鉴定

2.4.5 rBMSCs骨向分化能力鉴定

2.4.6 rBMSCs脂向分化能力鉴定

2.5小结

3.1实验目的

3.2实验方法

3.2.1实验试剂及设备

3.2.2 诱导rBMSCs为肝祖细胞

3.2.3免疫荧光法检测4组rBMSCs第6d的AFP表达情况

3.2.4 化学发光免疫法检测4组rBMSCs第6d及10d的AFP表达情况

3.3实验结果

3.3.1 rBMSCs定向诱导为肝祖细胞的形态变化

3.3.2各组rBMSCs第6d的AFP表达情况测定

3.3.3各组rBMSCs第6、10d的AFP含量测定

3.4小结

4实验部分 17β-雌二醇对rBMSCs肝向分化过程中Hedgehog信号

通路的调控作用

4.1实验目的

4.2实验方法

4.2.1实验试剂及设备

4.2.5灌胶

4.2.5电泳

4.2.6转膜

4.2.7封闭液封闭

4.2.8一抗孵育

4.2.9二抗孵育

4.2.10化学发光、凝胶成像

4.3实验结果

4.4小结

讨论

小结

问题与展望

参考文献

缩略语/符号说明

在读期间发表论文

致谢