内源性白介素-37对动脉粥样硬化小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子影响的研究

摘要

目的：　　本研究通过杂交白介素-37(interleukin-37, IL-37)转基因小鼠(IL-37+/+)和载脂蛋白E(apolipoprotein, APOE)基因敲除小鼠(APOE-/-)，繁育出IL-37+/+APOE-/-双基因修饰小鼠。在此基础上建立动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)小鼠模型，研究IL-37对小鼠AS斑块形成及AS模型小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子的影响，以及研究表达IL-37的小鼠腹腔巨噬细胞在AS中的作用，为未来AS的细胞因子靶向治疗提供新方向。　　方法：　　1.建立动脉粥样硬化小鼠模型：通过杂交IL-37+/+小鼠和APOE-/-小鼠，在后代中，取鼠尾用PCR法判断小鼠基因型，筛选出IL-37+/+APOE-/-双基因纯合小鼠，后续实验中选用雄性的目标双基因纯合小鼠。实验分成四组：(1)APOE-/-小鼠(n=10)；(2)IL-37+/+APOE-/-小鼠(n=10)；(3)IL-37+/+小鼠(n=10)；(4)野生型小鼠(n=10)，四组雄性小鼠在8周龄时，使用高脂饮食饲养10周后，处死小鼠并收集标本。　　2.血清检测及病理切片染色：取四组小鼠眼眶静脉血，检测甘油三酯(triglycerides，TC)、总胆固醇(total cholesterol，TCHO)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol， LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的血清浓度。Elisa法和流式细胞仪测定血清中IL-37、IL-6，IFN-γ，TNF-α和IL-10的浓度。取小鼠主动脉根部组织作冰冻切片，分别用油红O染色及HE染色检测脂质斑块的形成情况。　　3.腹腔巨噬细胞鉴定及明确IL-37表达：收集小鼠腹腔巨噬细胞，用CD68和IL-37抗体免疫荧光标记巨噬细胞和IL-37的表达。用蛋白免疫印迹(western blot，WB)比较IL-37蛋白表达水平。　　4.巨噬细胞分型、炎症因子水平及NF-κB蛋白表达差异：分别用CD68抗体标记巨噬细胞，CD11c抗体标记巨噬细胞M1型，CD206抗体标记巨噬细胞M2型，用流式细胞仪检测M1型和M2型腹腔巨噬细胞分型结果。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测腹腔巨噬细胞中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的mRNA水平。WB检测巨噬细胞中NF-κB蛋白水平。　　结果：　　1.基因型鉴定结果及病理分析：主动脉根部组织油红O染色及HE染色结果提示：与IL-37+/+组和野生型小鼠对比，APOE-/-组和IL-37+/+APOE-/-组主动脉根部组织可见明显脂质斑块形成(p＜0.05)。IL-37+/+APOE-/-组小鼠的脂质斑块面积明显较APOE-/-组减少(p＜0.05)。　　2.血清血脂和相关炎症因子水平：高脂饮食后IL-37+/+和野生型组的血脂水平(TCHO、LDL-C和TC)明显低于APOE-/-组和IL-37+/+APOE-/-组(p＜0.05)。IL-37+/+APOE-/-组小鼠的血清中TC浓度较APOE-/-组小鼠下降(p＜0.05)，而LDL-C的血清浓度也呈现相同的趋势(p＜0.05)。HDL-C血清浓度组间无差异(p＞0.05)。高脂饮食前后，IL-37+/+组小鼠和IL-37+/+APOE-/-组小鼠的IL-37血清浓度明显高于APOE-/-组小鼠和野生型小鼠(分别为p＜0.01和p＜0.05)。高脂饮食后血清IL-6、TNF-α和IFN-γ蛋白浓度为APOE-/-组＞IL-37+/+APOE-/-组＞IL-37+/+组及野生型小鼠(p＜0.05)。而与APOE-/-小鼠比较，IL-37+/+APOE-/-小鼠的血清IL-10蛋白浓度明显升高(p＜0.05)。　　3.巨噬细胞及其IL-37表达分析：高脂饮食后小鼠腹腔巨噬细胞免疫荧光染色结果显示IL-37在IL-37+/+APOE-/-小鼠腹腔巨噬细胞内强阳性表达，而在IL-37+/+小鼠体内基本不表达。对比APOE-/-小鼠，IL-37+/+APOE-/-小鼠腹腔巨噬细胞的IL-37蛋白水平明显增加(p＜0.05)，而IL-37+/+小鼠的IL-37蛋白水平水平组间无明显差异(p＞0.05)。　　4.巨噬细胞M1/M2分型：高脂饮食后对比APOE-/-组小鼠，IL-37+/+APOE-/-组小鼠M1型腹腔巨噬细胞的占比明显下降(p＜0.05)。此外，IL-37+/+APOE-/-小鼠M2型腹腔巨噬细胞的占比较APOE-/-组小鼠明显增高(p＜0.05)。IL-37+/+APOE-/-小鼠的M1/M比值较APOE-/-组小鼠明显降低(p＜0.05)。　　5.巨噬细胞炎症因子和NF-κB蛋白水平的差异：高脂饮食后巨噬细胞中IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平为APOE-/-组＞IL-37+/+APOE-/-组＞IL-37+/+组及野生型小鼠(p＜0.05)。对比APOE-/-组小鼠，IL-37+/+APOE-/-组小鼠来源的腹腔巨噬细胞IL-10的mRNA表达水平明显上调(p＜0.05)。结果与小鼠血清IL-10的蛋白浓度差异趋势吻合。此外，与APOE-/-组小鼠对比，IL-37+/+APOE-/-组小鼠来源的腹腔巨噬细胞的NF-κB表达明显降低(p＜0.05)。　　结论：　　本研究通过杂交繁育出IL-37+/+APOE-/-小鼠，并经过高脂饮食后建立稳定的IL-37内源性高表达AS小鼠模型。IL-37+/+APOE-/-模型小鼠的腹腔巨噬细胞可以表达IL-37，通过调节小鼠体内M1和M2的极化平衡和促炎及抑炎反应的整体平衡，从而抑制AS中的炎症反应和减少斑块形成。此外，巨噬细胞表达的IL-37在AS中表现出抑制炎症作用，可能与抑制NF-κB相关炎症细胞通路的激活有关。

目录

声明

主要中英文缩略词对照表

1 研究背景

1.1 动脉粥样硬化简介

1.2 IL-37整体结构和相应组织的分布

1.3 抗炎因子IL-37

1.4 关于IL-37在动脉粥样硬化发病过程中的研究

1.5巨噬细胞的动态平衡及其与IL-37在AS中作用

2 研究材料

2.1 研究对象

2.2 实验准备

2.2.1主要实验试剂采购及溶液的制备

2.2.2 主要仪器设备及其他

3 研究方法

3.1 技术路线

3.2小鼠基因型鉴定

3.3模型小鼠筛选繁育

3.4组织标本取材

3.5 主动脉根部组织染色

3） 主动脉根部HE染色

3.6 血清血脂水平检测

3.7血清炎症因子蛋白水平检测

3.8 IL-37的免疫荧光染色及巨噬细胞表达的鉴定

3.9 腹腔巨噬细胞炎症细胞因子的mRNA 相对表达量测定

1） 一步Trizol法提取腹腔来源的巨噬细胞总RNA

2） 巨噬细胞炎症因子的cDNA合成及RT-PCR检测

3.10 流式细胞仪检测巨噬细胞M1及M2分型变化分析

3.11巨噬细胞中相关蛋白质含量检测

1） 巨噬细胞中的蛋白提取

2） 灌制胶板

3） 电泳

4） WB转膜及封闭

5） 孵育抗体

6） 拍照及收集数据

3.12 统计学分析

4 结果

4.1 IL-37及APOE双基因纯合小鼠的模型构建

4.2 主动脉AS斑块组织染色结果

4.3 血脂水平的检测

4.4 高脂饮食干预前后血清IL-37水平的变化

4.5 血清中AS相关炎症因子检测

4.6 AS小鼠腹腔巨噬细胞IL-37蛋白的测定分析

4.7 M1及M2腹腔巨噬细胞的变化

4.8 小鼠腹腔巨噬细胞AS相关炎症细胞因子的mRNA表达水平

4.9 NF-κB蛋白在腹腔巨噬细胞中的表达水平

5 讨论

6 结论

参考文献

在校期间发表论文情况

致谢