重组人CTLA-4胞外段的表达纯化及其纳米抗体的筛选与功能鉴定

摘要

目的：　　本研究旨在通过大容量噬菌体纳米抗体文库筛选出与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)结合的纳米抗体，为其后续应用开发奠定物质基础。　　方法与结果：　　(1)通过在Uniprot蛋白数据库中查找CTLA-4胞外段(CTLA-4 ECD)序列并合成到pCMV真核表达载体上，得到pCMV-CTLA-4ECD重组蛋白表达质粒。并用PCR扩增，酶切，连接，转化等技术，亚克隆得到pcDNA3.4-CTLA-4ECD重组蛋白表达质粒。　　(2)通过少量瞬转，比较两种重组质粒的表达量，确定用pCMV-CTLA-4ECD大量瞬转入HEK293F细胞，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，最终获得CTLA-4ECD蛋白，其与CTLA-4mAb有结合活性，且蛋白纯度大于90%。　　(3)首先，扩增辅助噬菌体VCSM13，辅助噬菌体滴度为5×1012cfu/mL，再利用纯化得到的CTLA-4ECD蛋白进行包板，利用大容量天然噬菌体纳米抗体文库，经过首轮扩增，3轮淘洗，最后筛选。最后，获得具有纳米抗体序列差异的3株纳米抗体，其被命名为NbCTLA-4ECD，分别记作F2、E3、G4。通过软件分析NbCTLA-4ECD的理化特性，其分子质量在17.4-18.1kDa范围内，理论等电点在6.27-9.3范围内，由于3株纳米抗体的GRAVY都小于0，则为亲水性蛋白。　　(4)少量抽提pMECS-NbCTLA-4ECD，将其电转入E.coliWK6中，通过终浓度为1mM的IPTG诱导菌种表达，然后使用高渗透压差法提取纳米抗体，蛋白质经Ni-NTA柱纯化，NbCTLA-4ECD蛋白纯度达93%以上。3株NbCTLA-4ECDWK6的蛋白产量在4.66-5.84mg/L范围内，其中产量最高的是G4，达到了5.84mg/L。　　(5)通过ELISA检测NbCTLA-4ECD特异性与热稳定性。特异性实验证明，3株NbCTLA-4ECD均与CTLA-4ECD特异性结合能力较强，与其它6种对照抗原的结合能力较弱，G4具有最强的结合能力。热稳定性实验证明，NbCTLA-4ECD与阳性对照CTLA-4mAb相比在60℃处理下具有明显优势。　　(6)借助A375黑色素瘤细胞，研究3株纳米抗体与细胞膜上CTLA-4分子的特异性结合活性，通过流式检测显示，3株纳米抗体均能识别细胞膜表面表达的CTLA-4，且G4的结合活性最高。　　结论：　　本文成功构建了真核表达质粒，并通过发酵纯化最终获得具有结合活性且纯度大于90%的CTLA-4ECD重组蛋白，包被得到的抗原蛋白，从噬菌体纳米抗体文库中淘洗筛选得到3株与CTLA-4ECD结合的纳米抗体。具有分子量小，热稳定性高，特异性强等特点，且与A375细胞膜上CTLA-4蛋白有一定的结合活性。综上所述，筛选出的3株纳米抗体均有开发成为阻断CTLA-4的抑制剂潜力，为其后续应用开发奠定了物质基础。

目录

声明

第一章 前言

1.1 免疫检查点及其抑制剂

1.1.1 免疫检查点

1.1.2 免疫检查点抑制剂

1.2 CTLA-4与肿瘤

1.2.1 CTLA-4的结构与功能

1.2.2 CTLA-4相关肿瘤

1.3 纳米抗体

1.3.1 纳米抗体的结构与序列

1.3.2 纳米抗体的理化性质及功能特点

1.3.3 纳米抗体在疾病治疗和诊断领域的应用

1.3.4 纳米抗体在疾病治疗上存在的问题

1.4 本课题研究目的及意义

1.5 技术路线

第二章 人 CTLA-4 胞外段蛋白的表达、纯化及鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 主要仪器设备及耗材

2.1.2 质粒、菌种与细胞株

2.1.3 主要试剂与试剂盒

2.1.4 主要试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1pCMV-CTLA-4 ECD重组质粒的合成与鉴定

2.2.2 pcDNA3.4-CTLA-4 ECD重组质粒的构建及鉴定

2.2.3 CTLA-4胞外段蛋白在HEK 293F细胞中的表达验证

2.2.4 CTLA-4胞外段蛋白的纯化与浓缩

2.2.5 CTLA-4胞外段蛋白活性验证（ELISA）

2.3 实验结果

2.3.1 pCMV-CTLA-4 ECD重组质粒的菌落PCR验证

2.3.2CTLA-4 ECD基因片段酶切装载及验证

2.3.3重组质粒pcDNA3.4-CTLA-4 ECD双酶切验证

2.3.4比较pCMV-CTLA-4 ECD和pcDNA3.4-CTLA-4 ECD瞬转表达量

2.3.5 CTLA-4 胞外段蛋白的表达与纯化

2.3.6 CTLA-4 胞外段蛋白活性验证

2.4 本章小结与讨论

第三章NbCTLA-4 ECD序列的筛选

3.1 实验材料

3.1.1 主要仪器设备及耗材

3.1.2 纳抗筛选相关用品

3.1.3 主要试剂

3.1.4 主要试剂配制

3.2 实验方法

3.2.1 辅助噬菌体（VCSM13）扩增与制备

3.2.2 噬菌体纳抗文库扩增

3.2.3 噬菌体纳抗文库淘洗

3.2.4 每轮淘洗后纳抗文库的富集验证

3.2.5CTLA-4 ECD噬菌体纳抗文库筛选

3.2.6 CTLA-4 ECD纳米抗体的表达纯化

3.3 实验结果

3.3.1 辅助噬菌体（VCSM13）的制备

3.3.2 淘洗及富集验证结果

3.3.3 CTLA-4 ECD噬菌体纳米抗体文库筛选

3.3.4 阳性转化子的序列分析

3.3.5 NbCTLA-4 ECD理化性质分析

3.3.6NbCTLA-4 ECD表达、纯化与鉴定

3.4 本章小结与讨论

第四章 NbCTLA-4 ECD功能初步探究

4.1 实验材料

4.1.1 主要仪器设备及耗材

4.1.2 细胞株

4.1.3 主要试剂

4.1.4 主要试剂配制

4.2 实验方法

4.2.1 NbCTLA-4 ECD的理化性质

4.2.2 NbCTLA-4 ECD生物活性研究

4.3 实验结果

4.3.1 NbCTLA-4 ECD的理化性质检测

4.3.2 NbCTLA-4 ECD生物活性检测

4.4 本章小结与讨论

第五章 全文总结及展望

5.1 全文总结

5.2 本文主要创新点

5.3 展望

参考文献

英文缩写表

硕士期间发表论文

致谢