Wnt/β-catenin通路在HS抑制大鼠肝脏缺血/再灌注损伤中的作用

摘要

目的　　通过建立SD大鼠肝脏部分缺血再灌注损伤模型，观察饱和氢气生理盐水预处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤作用。通过病理检测、测定大鼠肝功能、肝组织氧化应激指标和Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平，从分子学层面探讨Wnt/β-catenin通路在氢气生理盐水减轻大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用，为氢气在减轻肝脏缺血再灌注损伤的临床应用提供理论基础。　　方法　　随机将40只雄性SD大鼠分为5组，Sham组，I/R1+NS组和I/R1+HS组，I/R2+NS组和I/R2+HS组。除Sham组外，I/R1组、I/R2组缺血时间分别为20min，60min，其再灌注时间均为6h。含NS组术前15分钟腹腔注射生理盐水，HS组术前15分钟腹腔注射饱和氢气生理盐水，剂量为10ml／Kg。采用国内外广泛认可的Nauta法建立肝缺血再灌注模型，阻断70%的肝脏血液供应。在各组大鼠肝脏再灌注6h后取检测样本，检测血清ALT、AST含量；比色法检测肝组织中MDA、MPO含量；显微镜观察肝组织病理形态学改变；应用TUNEL检测肝细胞凋亡情况；Westernblot检测肝组织β-连环蛋白和DKK-1蛋白蛋白表达水平。　　结果　　1.对大鼠肝脏缺血时间分别为20min、60min，恢复血流再灌注6h后，各对照组和试验组与Sham组对比，血清中ALT、AST水平明显升高(P＜0.05)；缺血时间越长血清ALT、AST水平升高明显(P＜0.05)；实验组与对照组相比，实验组中血清ALT、AST水平更低(P＜0.05)，而实验组2中血清ALT、AST降低更加明显(P＜0.01)。　　2.对SD大鼠70%肝缺血模型再灌注6h后，其中假手术组MDA和MPO水平没有明显变化。与假手术组比较，对照组和实验组肝组织中MDA、MPO含量均显著升高，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；而与对照组相比，实验组中MDA和MPO水平明显降低，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。　　3.Sham组呈现正常肝脏结构形态，I/R1+NS组：肝小叶结构可见，结构基本正常，细胞排列基本整齐，可见部分肝细胞水肿，未见细胞明显凋亡或坏死。I/R1+HS组:肝小叶结构清晰可见，肝脏细胞排列整齐，极少细胞水肿及炎性细胞浸润，未见凋亡或坏死细胞。I/R2+NS组：肝小叶结构明显改变，细胞索排列紊乱，细胞水肿明显，膨大呈球形，可见明显空泡形成及点状坏死，汇管区周围大量炎症细胞集聚、浸润，部分汇管区可见碎片装坏死，部分肝细胞皱缩、胞质嗜酸，细胞核固缩呈现肝细胞凋亡。与I/R2+NS组比较，I/R2+HS组组肝小叶结构明显清晰，肝细胞排列稍整齐、水肿减轻，部分呈空泡状，散在的点状坏死，汇管区炎性细胞集聚、浸润明显改善，少部分肝细胞皱缩、胞质嗜酸，细胞核固缩呈现肝细胞凋亡状态。　　4.TUNEL检测发现，与假手术组对比，对照组中阳性细胞的数量明显增多，肝细胞凋亡指数明显增高(P＜0.01)；与对照组相比，相应缺血时间实验组阳性细胞的数量均减少，尤其是实验2组中减少明显，肝细胞凋亡指数下降(P＜0.01)。　　5.假手术组中没有明显的DKK-1表达。对照组中DKK-1表达上调，与对照组相比较，对应缺血时间实验DKK-1表达下降(P＜0.05)；与假手术组对比，对照组中β-catenin蛋白的表达下调了。而经HS预处理后，与对照组比较，实验组β-catenin蛋白的表达上调，但仍低于假手术组。　　结论　　1.饱和氢气生理盐水预处理明显减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤。　　2.饱和氢气生理盐水可能通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，通过抑制β-catenin蛋白的降解，抑制DKK-1蛋白的表达，从而进入细胞核调控细胞凋亡和炎症起到对肝脏缺血再灌注的保护作用。

目录

声明

1.前言

1.1自由基的生成增多与氧化应激

1.2钙超载

1.3炎症细胞浸润和库普弗细胞（Küpffer cell）的激活

1.4细胞凋亡

1.5 wnt/β-catenin信号通路

1.6 wnt/β-catenin通路相关蛋白

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1实验动物

2.1.2饱和氢气生理盐水（hydrogen-saturated saline,HS）制备

2.1.3 实验试剂与器材

2.2实验方法

2.2.1实验分组

2.2.2肝脏缺血-再灌注动物模型建立和取样

2.2.3实验标本的检测和处理

2.2.4 统计学分析

3．实验结果

3.1各组大鼠恢复灌注6h后肝功能（ALT、AST）的变化

3.2各组大鼠肝组织匀浆MDA、MPO的变化

3.3各组大鼠肝脏组织HE染色病理变化

3.4各组大鼠肝脏组织TUNEL结果及细胞凋亡情况

3.5各组大鼠肝脏组织中β-catenin蛋白和DKK-1蛋白表达情况

4.讨论

5.结论

6.不足与展望

参考文献

缩略词表

在校期间发表论文清单

致谢