非抗体结合蛋白在疟疾检测试剂盒的研究应用

摘要

疟疾是全球最严重的三大传染病之一，约一半人口面临疟疾风险，在我国，仍有部分地区存在疟疾感染病例。疟疾是由携带传染源的按蚊在叮咬人体时，将携带的疟原虫卵排入人体，感染到发病有一定潜伏期，其中疟原虫配子体在再吸刺的蚊子胃内发育成传染源子孢子，造成进一步传染。镜检和PCR核酸扩增测试是临床现有的疟疾检测方法，具有效率低、费用高、使用繁琐、产品存储运输困难等问题。因此，开发一种快速、简便、成本低、稳定性好的疟疾诊断产品非常有临床价值。　　本研究采用噬菌体展示技术以恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2(HRP2)和间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)为靶抗原，从英国利兹大学Darren教授构建的展示框架蛋白文库中淘选亲和力高、特异性好的非抗体结合蛋白(nABPs)。利用基因工程技术进行重组表达和纯化获得nABPs，建立胶体金免疫层析检测方法，在实验室和临床水平验证、比较其性能，开发出低成本、高性能的疟疾快速检测诊断试剂盒。　　经初步临床试验统计分析，阳性符合率达97.9%%，阴性符合率达95.5%，总符合率为96.9%，约登指数达到0.934，Kappa=0.936，常温运输存储稳定性可达3年以上。应用噬菌体展示技术制备的nABPs开发制备的疟疾胶体金法检测试剂，检测性能高，使用简便，存储容易，具有较高的临床应用价值。

目录

一 前言

1 研究背景

2 国内外研究现状

2.1 国内外疟疾疾病控制情况

2.2 国内外疟疾检测技术的发展情况

2.3 噬菌体展示技术发展概况

2.4 噬菌体展示技术在疟疾诊断方面的技术发展

3 研究内容

4 本课题研究的特点与创新性

4.1 研究技术特点

4.2 创新性

二 研究试验内容

1 实验材料

1.1 实验所用仪器

1.2 实验所用试剂及原材料

2 实验方法

2.1 非抗体结合蛋白（nABPs）的制备实验

2.2 nABPs的临床检测性能调试与测试

2.3 恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（HRP2）和间日疟原虫L乳酸脱氢酶（LDH）快速检测试剂（胶体金法）设计开发研究

2.4 恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2（HRP2）/疟原虫 L 乳酸脱氢酶（LDH）快速检测试剂（胶体金法）试生产与性能评估

2.5 用于制备疟疾检测试剂的nABPs氨基酸序列分析

三 实验结果

1.测试验证目标蛋白的淘选结果

2 目标蛋白表达后的配对测试结果

3 nABPs的临床检测性能测试

3.1 针对乳酸脱氢酶（LDH）与富组氨酸蛋白2（HRP2）的nABPs生物素化标记效果测试

3.2 nABPs配对测试结果

3.3 用于包被的nABPs浓度测试

3.4 用于最低检测限的测定结果

3.5 配对nABPs采用ELISA方法的临床检测性能测试

4 恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2（HRP2）和间日疟原虫 L乳酸脱氢酶（LDH）快速检测试剂（胶体金法）制备过程测试分析

4.1 制备质控品检测

4.2 胶体金层析法工艺制备分析

5 恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（HRP2）/疟原虫L乳酸脱氢酶（LDH）快速检测试剂（胶体金法）试生产与性能评估

5.1 采用确认工艺试生产恶性疟原虫检测试剂及间日疟原虫检测试剂产品按工艺流程试生产所得产品，如下图12所示。

5.2 对试生产产品进行性能评估测试

5.3 小试生产临床试验统计结果

四 讨论与结论

1 噬菌体展示技术淘选目标蛋白技术的应用讨论

2 ELISA筛选验证目标蛋白的方法讨论

3 噬菌体展示技术淘选的nABPs应用于疟疾胶体金层析法的产品设计开发

4 结论

五 展望

参考文献

英文缩写

研究生期间发表的论文清单与专利情况

1 发表的论文

2 专利情况

致谢