粗糙链孢霉LPMOs蛋白在毕赤酵母中的表达及其在木质纤维素降解中的应用研究

摘要

裂解性多糖单加氧酶(Lyticpolysaccharide monooxygenases，LPMOs)是一类纤维素降解辅助性酶类，在纤维二糖脱氢酶(Cellobiose dehydrogenase，CDH)等电子供体的辅助下，可使多糖链断裂，提高传统纤维素酶的水解效果。本研究将粗糙链孢霉中两个从未报道过LPMO基因和CDH基因转入毕赤酵母中，研究了重组LPMO-00760、LPMO-00836和CDH的酶学特性，以及它们促进商业化纤维素酶水解作用的效果。　　经测序、WesternBlot和特异性底物活性电泳验证，本研究在毕赤酵母中成功表达了粗糙链孢霉的LPMO-00760、LPMO-00836和CDH基因。重组LPMO-07760与LPMO-00836蛋白粗提液酶活力分别为13.74U/和7.85U/g；最适温度分别为35℃与40℃；最适pH分别为7.5与8.0；锰离子和铜离子能提高其酶活性。重组CDH的酶活为250U/L；在30-40℃之间热稳定性最好，最适pH为5.5。　　重组LPMO能有效促进商业化纤维素酶Celluclast1.5L的作用。以微晶纤维素为底物，与单独使用Celluclast1.5L相比，添加重组LPMO-07760或LPMO-00836后，葡萄糖产量分别提高了5.58和5.83倍。　　以抗坏血酸或重组CDH为电子供体时，与单纯商业化纤维素酶相比，添加LPMO-07760后，茭白秸秆水解转化率分别提高19%和19.8%；添加LPMO-00836后，水解转化率分别提高15.6%和20%。重组CDH作为电子供体效果比抗坏血酸更好。

目录

声明

第一章绪论

1.1生物质炼制概述

1.2木质纤维素的结构和组成特征

1.2.1纤维素

1.2.2半纤维素

1.2.3果胶

1.2.4木质素

1.3木质纤维素预处理技术

1.4纤维素酶

1.5木质纤维素降解体系的反应

1.6碳水化合物活性酶数据库

1.7裂解性多糖单加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenases， LPMOs）

1.7.1 AA9-LPMOs

1.7.2 AA10-LPMOs

1.7.4 AA12-LPMOs

1.7.5 AA13-LPMOs

1.7.6 AA14-LPMOs

1.7.7 AA15-LPMOs

1.8 LPMOs活性测定

1.8.1间接法测定LPMOs活性

1.8.2直接法测定LPMOs活性

1.9毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统

1.10本研究目的和意义

第二章粗糙链孢霉AA9家族LPMOs基因的克隆

2.1引言

2.2实验材料

2.2.2培养基

2.2.3主要试剂

2.2.4仪器设备

2.2.5需配试剂

2.3实验方法

2.3.1粗糙链孢霉菌种的选择及鉴定

2.3.2粗糙链孢霉AAA9-LPMOs基因的获取

2.3.4粗糙链孢霉AA9-LPMOs基因重组表达载体的构建

2.4结果与分析

2.4.1粗糙链孢霉菌株的活化培养、镜检及ITS鉴定

2.4.2粗糙链孢霉总RNA的提取

2.4.3粗糙链孢霉AA9-LPMOs基因的扩增

2.4.4 AA9-LPMOs基因与T载体连接

2.4.5 AA9-LPMOs基因的T载克隆及鉴定

2.4.6 AA9-LPMOs基因与pPICZaA表达载体的连接

2.4.7重组表达载体pPICZ-LPMOs转化子的鉴定

2.5 讨论

第三章AA9-LPMOs基因在毕赤酵母中表达

3.1引言

3.2实验材料

3.2.2培养基、主要试剂和仪器设备

3.2.3需配试剂

3.3 AA9-LPMO在毕赤酵母中表达

3.3.1重组表达载体pPICZaA-AA9LPMO电击转化毕赤酵母

3.3.2重组AA9-LPMO蛋白的诱导表达

3.3.3蛋白浓度测定

3.3.4重组AA9-LPMO蛋白SDS-PAGE电泳

3.3.5重组AA9-LPMO蛋白Western blot

3.3.6重组AA9-LPMO蛋白SDS-PAGE活性电泳

3.3.7重组AA9-LPMO蛋白酶活力测定

3.4实验结果

3.4.1重组表达载体pPICZ-LPMO的线性化

3.4.2重组表达载体pPICZ-LPMO电击转化毕赤酵母

3.4.3重组AA9-LPMO蛋白的诱导表达

3.4.4重组AA9-LPMO蛋白的SDS-PAGE电泳分析

3.4.5重组AA9-LPMO蛋白的Western Blot分析

3.4.6重组AA9-LPMO蛋白的羧甲基纤维素酶活性电泳

3.4.7重组AA9-LPMO蛋白基于2,6-DMP-H2O2活性电泳

3.4.8重组AA9-LPMO蛋白的酶活力检测

3.5讨论

第四章纤维二糖脱氢酶在毕赤酵母中的表达

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1实验菌株和质粒

4.2.2培养基、主要试剂和仪器设备

4.2.3需配试剂

4.3 CDH基因的克隆

4.4重组表达载体pPICZ-CDH电击转化毕赤酵母

4.5重组CDH蛋白的诱导表达

4.6重组CDH蛋白SDS-PAGE凝胶电泳

4.7重组CDH蛋白的Western blot

4.8重组CDH蛋白活性电泳

4.8.2显色琼脂糖凝胶制备

4.8.3 Native-PAGE电泳

4.9重组CDH蛋白酶活力测定

4.9.2重组CDH的热稳定性

4.9.3 pH对重组CDH酶活性的影响

4.9.4重组CDH的酶动力学测定

4.10实验结果

4.10.1 粗糙链孢霉CDH 基因的克隆

4.10.2 CDH 基因的T 载克隆及鉴定

4.10.3 CDH 基因毕赤酵母表达载体pPICZ-CDH 的构建

4.10.4 CDH 在重组毕赤酵母中的诱导表达

4.10.5 重组CDH 的Western blot 分析

4.10.6 重组CDH 的酶活性电泳检测

4.10.7 重组CDH 的酶学性质

4.10.8 重组CDH 的酶动力学测定

4.11讨论

5.1 前言

5.2材料与仪器

5.3重组LPMO水解PASC产物的薄层层析

5.3.1磷酸膨胀纤维素的制备

5.3.2重组LPMO降解磷酸膨胀纤维素

5.3.3薄层层析步骤

5.4重组AA9-LPMO参与纤维素酶水解微晶纤维素

5.4.2以重组CDH为电子供体重组AA9-LPMO参与纤维素酶水解微晶纤维素

5.5茭白秸秆的预处理

5.5.1茭白秸秆的前期处理

5.5.2不同浓度氢氧化钠预处理茭白秸秆

5.5.3茭白秸秆的成分测定

5.5.4重组AA9-LPMO蛋白联合Celluclast 1.5L水解茭白秸秆

5.6实验结果

5.6.1重组LPMO水解磷酸膨胀纤维素PASC产物的薄层层析

5.6.2重组LPMO协助纤维素酶水解微晶纤维素

5.6.3茭白秸秆成分测定

5.6.4重组AA9-LPMO蛋白联合Celluclast 1.5L水解茭白秸秆

5.7讨论

全文总结与展望

参考文献

在校参与发表的论文

致谢