孢子表面疏水蛋白在病原真菌与寄主昆虫互作中的作用

摘要

昆虫缺乏获得性免疫系统，但在长期的进化过程中形成了复杂的天然免疫系统。因此，当外来病原微生物入侵寄主昆虫时，昆虫会启动天然免疫系统来抵抗病原微生物的入侵。　　在昆虫与病原真菌的相互作用过程中，病原真菌孢子表面的疏水蛋白对病原真菌进入寄主昆虫体内至关重要。最新研究发现，附着在昆虫体壁的真菌孢子在萌发前就已引起寄主产生体液免疫反应，表明寄主昆虫对真菌孢子表面物质具有快速的免疫反应。疏水蛋白是真菌孢子表面的最外层结构蛋白，可能在寄主免疫反应中起作用。木霉(richoderma asperellum)疏水蛋白能够促进杨树水杨酸和茉莉酸途径基因上调表达、提高杨树抵抗木霉侵染的能力。在人类机会病原真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中，去除病原真菌孢子表面疏水蛋白能够激活寄主免疫反应，因此其作用被认为是保护病原真菌躲避寄主免疫反应。然而，迄今为此，昆虫病原真菌孢子表面疏水蛋白在真菌孢子与寄主互作中的作用还不清楚。　　东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)是重大的农业害虫，属于直翅目昆虫的典型代表，具有完善的防御系统。东亚飞蝗的特异性病原真菌—蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)已广泛用于蝗虫防治。蝗绿僵菌与东亚飞蝗是研究昆虫与病原真菌共同进化的一个理想模式。为了阐明不同寄主范围的病原真菌孢子表面疏水蛋白在昆虫早期免疫反应中的作用，本研究以能够侵染东亚飞蝗的蝗绿僵菌菌株(Metarhizium acridum)CQMa102专一菌株、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa421广谱菌株和球孢白僵菌(Beauveria basiana)菌株ZJU435广谱菌株为材料，分别提取孢子表面疏水蛋白，测试它们对东亚飞蝗免疫反应的影响。在此基础上，进一步分析和确认病原真菌孢子表面疏水蛋白在昆虫早期免疫反应中的作用。　　用蝗绿僵菌CQMa102、金龟子绿僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435孢子表面提取的疏水蛋白分别点滴处理东亚飞蝗，只有蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白处理蝗虫后，蝗虫血淋巴中血细胞数量显著减少，酚氧化酶活性显著提高；金龟子绿僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435孢子表面疏水蛋白对东亚飞蝗五龄虫后血细胞数量和酚氧化酶活性均没有显著影响。上述结果表明：只有专一菌株蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白能够激活东亚飞蝗的体液免疫和细胞免疫。因此，进一步系统开展蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白激活东亚飞蝗免疫响应机制的研究。　　采用疏水作用层析和离子交换层析分离纯化、测序鉴定出了蝗绿僵菌孢子表面疏水蛋白MacHYD3，在大肠杆菌中表达和纯化得到rMacHYD3，制备了该疏水蛋白的抗体，免疫组化实验结果表明MacHYD3位于蝗绿僵菌孢子表面。点滴或者注射MacHYD3处理东亚飞蝗都能显著提高东亚飞蝗对真菌的抵抗能力，但对大蜡螟和草地贪夜蛾抵抗金龟子绿僵菌的能力无显著影响。蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白和蝗绿僵菌孢子同时注射到蝗虫体内12小时后，蝗虫体内结节数量显著增多，提高蝗虫抗真菌侵染的能力(LT50提高1.62天)。MacHYD3处理东亚飞蝗导致血细胞数量显著减少、酚氧化酶活性显著提高、吞噬细胞比例显著增加和免疫相关基因显著上调表达，rMacHYD3处理东亚飞蝗导致血细胞数量显著减少，酚氧化酶活性显著提高。可见：专一菌株蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白只能激活其专一寄主“东亚飞蝗”的体液免疫和细胞免疫，提高其专一寄主抵抗真菌的能力。　　综上所述，主要研究结果如下：　　1蝗绿僵菌CQMa102点滴处理东亚飞蝗五龄虫，会导致蝗虫血细胞数量显著减少、吞噬细胞比例显著增加，酚氧化酶活性显著提高，脂肪体中免疫相关基因的表达水平显著上调；　　2蝗绿僵菌孢子表面疏水蛋白MacHYD3处理东亚飞蝗会导致蝗虫血细胞数量显著减少、吞噬细胞比例显著增加酚氧化酶活性显著提高以及肪体中免疫相关基因的表达水平显著上调；金龟子绿僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435孢子表面疏水蛋白对东亚飞蝗血细胞数量和酚氧化酶活性都没有显著影响；　　3蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白MacHYD3点滴或者注射处理东亚飞蝗，会增强东亚飞蝗抵抗真菌的能力，但对大蜡螟和草地贪夜蛾的抗真菌能力没有显著影响；　　4蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白MacHYD3和绿僵菌CQMa102孢悬液同时注射处理东亚飞蝗，东亚飞蝗体内结节数量显著增多。

目录

1绪 论

1.1昆虫病原菌在昆虫种群数量调控中的作用

1.2寄主昆虫防卫病原真菌的机制研究进展

1.3昆虫病原真菌躲避寄主免疫反应的机制研究

1.4真菌疏水蛋白研究进展

1.5疏水作用层析

1.6离子交换作用层析

1.7研究目的

1.8研究意义

1.9 研究技术路线和内容

2实验材料与方法

2.1 蝗绿僵菌CQMa102孢子对东亚飞蝗免疫反应的影响

2.2 蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白对东亚飞蝗免疫反应的影响

2.3金龟子绿僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435孢子表面疏水蛋白对东亚飞蝗免疫反应的影响

2.4 蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白对昆虫抗真菌侵染能力的影响

2.5 主要使用的软件和统计分析方法

3 结果与分析

3.1蝗绿僵菌CQMa102孢子激活东亚飞蝗免疫反应

3.2 蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白的提取、纯化、鉴定以及定位

3.3 蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白MacHYD3显著增强东亚飞蝗抵抗病原真菌的能力

3.4 蝗绿僵菌CQMa102孢子表面疏水蛋白激活东亚飞蝗免疫反应

3.5 金龟子绿僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435孢子表面疏水蛋白对东亚飞蝗五龄虫抗菌能力无显著影响

3.6 金龟子绿僵菌CQMa421和白僵菌ZJU435孢子表面疏水蛋白对东亚飞蝗免疫反应的影响

4 讨论

4.1 蝗绿僵菌CQMa102孢子对东亚飞蝗免疫反应的影响

4.2 昆虫病原真菌孢子表面疏水蛋白对东亚飞蝗五龄虫抵抗绿僵菌能力的影响

4.3昆虫病原真菌孢子表面疏水蛋白对昆虫免疫反应的影响

5 主要结论与后续工作建议

5.1主要结论

5.2 本文创新点

5.3 后续工作建议

参考文献

附录

A. 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录

B. 学位论文数据集

致谢