昆虫滞育激素—性信息素合成激活肽基因的结构特性、发育表达、功能的分析及其转录调控机理的研究

摘要

鳞翅目昆虫DH-PBAN cDNA编码滞育激素(DH)、性信息素合成激活肽(PBAN)和另外三个神经肽,这五个神经肽都有共同的FX PR/KL(X=G,T,S)酰胺化的C末端.DH-PBAN基因主要在咽下神经节(SG)表达.DH在家蚕(Bombyx mori)中被证明具有诱导卵滞育的功能,PBAN则在鳞翅目昆虫中起到促进性信息素合成的作用.DH-PBAN基因存在于几种蛹滞育的鳞翅目昆虫中,但除PBAN能促进性信息素合成的功能外,其他神经肽功能还未知.我们试图研究DH-PBAN基因在棉铃虫(Helicoverpa armigera)蛹滞育中的功能,为此首先克隆了棉铃虫DH-PBAN cDNA,它编码194个氨基酸前体肽,根据保守的蛋白水解位点,经酶切后可得到33个氨基酸的PBAN,24个氨基酸的DH和另外三个FXPRL神经肽.同源比较发现棉铃虫DH-PBAN编码的神经肽与其他已知鳞翅目DH-PBAN编码的神经肽有高度同源性.与家蚕诱导滞育的功能不同,注射DH并不能诱导棉铃虫蛹滞育.Northern blot和半定量RT-PCR分析的结果表明非滞育棉铃虫蛹SG的DH-PBAN mRNA含量显著高于滞育蛹.根据这一现象,给滞育棉铃虫注射DH,提高其体内DH含量,可有效地打破棉铃虫的蛹滞育.这说明DH-PBAN基因的高表达可以促进棉铃虫的蛹发育,而低表达可以使到它进入滞育.进一步发现DH解除蛹滞育的功能是温度依赖的.体内和体外的实验证明DH能刺激前胸腺产生蜕皮激素,说明DH可能是通过提高体内的蜕皮激素量达到解除滞育的功能.

目录

摘要

Abstract

第一部分棉铃虫滞育激素-性信息素合成激活肽基因的克隆及其编码神经肽在蛹滞育中的功能

一.综述

1.1昆虫肽类激素概述

1.2昆虫滞育的种类和相应的激素调节机制

1.3昆虫滞育激素-性信息素合成激活肽(DH-PBAN)的基因结构和功能

1.4棉铃虫的生活史及滞育特性，及其研究意义

二.实验流程图

三.材料与方法

3.1棉铃虫的饲养和基本操作

3.2质粒DNA小量抽提

3.3质粒DNA大量抽提

3.4大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化

3.5总RNA抽提和mRNA纯化

3.6基因组DNA抽提

3.7λ噬菌体培养及其DNA抽提

3.8 PCR及引物设计

3.9 DNA电泳和DNA胶回收

3.10 DNA重组(酶切，磷酸化和连接)

3.11基因组噬菌体文库的构建

3.12基因组DNA文库的筛选

3.13 cDNA文库的构建

3.14 Northern杂交

3.15 Southern杂交

3.16半定量RT-PCR

3.17链末端终止法测序

3.18引物延伸分析

3.19昆虫蜕皮激素的放免测定

3.20数据的统计和分析

四.PCR引物表

五.结果与讨论

5.1棉铃虫DH-PBANcDNA的克隆及其结构和时空表达的分析

5.2棉铃虫DH及其它FXPRL神经肽解除蛹滞育的功能及其可能的机理

5.3棉铃虫DH-PBAN基因的克隆和结构分析

5.4第一部分的总结和展望

六.参考文献

第二部分家蚕和棉铃虫DH-PBAN基因的部分转录调控机理及POU在棉铃虫神经系统发育中的可能作用

一.综述

1.1动物的进化与转录调节的关系

1.2基因特异转录的主要调节机理

1.3真核生物转录调控研究的基本原理方法

1.4神经肽基因的转录调节机理

1.5 DH-PBAN基因转录调控的研究意义

二.实验流程图

三.材料与方法

3.1细胞核蛋白和胞质蛋白抽提

3.2凝胶阻滞分析

3.3荧光素酶报告基因的质粒构建

3.4昆虫细胞的培养和DNA质粒的转染

3.5细胞的裂解和荧光素酶和β-Galactosidase活性的测定

3.6 DNA-蛋白质的紫外交联实验

3.7 cDNA末端快速扩增(RACE)

3.8重组质粒的体外表达

3.9转录因子部分纯化

四.凝胶阻滞分析探针和PCR引物表

4.1用于凝胶阻滞分析的探针

4.2 PCR引物表

五.结果与讨论

5.1POU及一种未知蛋白(DHMBP-2)结合到家蚕DH-PBAN启动子上

5.2 POU-M1/-M2特异激活家蚕DH-PBAN启动子的转录活性

5.3POU-M1/-M2对棉铃虫DH-PBAN启动子活性的影响

5.4棉铃虫POU转录因子的克隆及其与神经系统发育的关系

5.5第二部分的总结和展望

六.参考文献

致谢

博士期间已发表和待发表的论文