连花清瘟抑制乙型流感病毒侵入、复制及免疫调节机制的研究

摘要

研究背景：　　流感病毒每年季节性流行严重威胁着人类健康，主要病原体包括季节性甲型流感病毒H1N1、H3N2和乙型流感病毒。每年流感季节，乙型流感病毒感染患者占总流感病毒感染患者的1%~40%，局部地区甚至达到50%左右。乙型流感病毒根据免疫原性和免疫性差异被分为Victoria系和Yamagata系两个遗传亚系。同时针对两个亚系的三价疫苗应用不广，分别针对两个亚系的两种单价疫苗的投放由世界卫生组织根据流行情况预测并推荐，存在预测错误的可能。抗流感病毒药物中，对乙型流感病毒有效的仅有神经氨酸酶抑制剂，其中应用最广泛的磷酸奥司他韦（商品名：达菲）对乙型流感病毒的效果比甲型流感病毒抑制效果差。可见，乙型流感病毒是一个常见、危险而又欠缺防治手段的病原体。　　2009年，中国卫生部为应对流感大流行，颁布《人感染甲型H1N1流感诊疗方案》，连花清瘟是推荐使用中药之一。连花清瘟是一个新型中药方剂，由银翘散、麻杏石甘汤配以红景天和大黄制成。于2009年以良好的疗效通过抗甲型H1N1流感病毒的随机、双盲、阳性对照的临床试验，被中国卫生部推荐为应对2009年H1N1流感大流行的中药之一。作为抗流感上市药物，连花清瘟对乙型流感病毒的作用仅限于体外药效证据，且数据极少（药理，体内，和临床都缺少）。与其他流感药物缺乏对乙型流感病毒研究一样，其中一个重要原因是乙型流感病毒缺乏可用于评价药效的实验动物模型。本研究的目标旨在系统地探讨连花清瘟对乙型流感体内外的药效与药理机制。　　研究目的：　　1、探讨连花清瘟体外对乙型流感病毒的抑制作用及作用机制。　　2、探讨连花清瘟对乙型流感感染的宿主免疫反应的作用和机制。　　3、探讨连花清瘟体内模型对乙型流感病毒的抑制作用。　　研究方法：　　1、以MDCK细胞感染乙型流感模型，探究连花清瘟对乙型流感病毒的抑制作用及作用模式。　　2、通过免疫荧光实验和病毒产量抑制实验研究连花清瘟对乙型流感病毒子代病毒产量的影响。　　3、通过血凝抑制实验和免疫荧光实验，探讨连花清瘟对乙型流感病毒入侵宿主细胞的抑制效果。　　4、应用实时定量PCR方法探索连花清瘟对乙型流感病毒感染导致的细胞因子表达的影响，进一步使用Western Blotting方法分析连花清瘟对相关信号通路的影响。　　5、小鼠感染致死性乙型流感病毒后口服给予连花清瘟，观察药物对感染小鼠肺组织病毒复制、病理变化和死亡率的影响。　　6、致死性乙型流感病毒感染小鼠口服不同剂量磷酸奥司他韦联合连花清瘟，观察连合用药对感染小鼠肺组织病毒复制和病理变化的影响。　　研究结果：　　1、连花清瘟对不同乙型流感病毒体外半数抑制浓度为0.228±0.150至0.754±0.161mg/mL，连花清瘟在病毒感染前处理病毒和感染后处理均有明显的抑制作用。　　2、MDCK细胞感染乙型流感病毒后，给予0.6mg/mL连花清瘟，明显减少病毒NP蛋白表达和子代病毒的产量。　　3、连花清瘟处理乙型流感病毒后明显降低病毒吸附于MDCK细胞表面的能力。　　4、连花清瘟明显抑制由乙型流感病毒感染引起的IFN-λ1、IL-6、IL-8、TNF-α、IP-10、MCP-1和MIP-1β等细胞因子表达，明显抑制STAT1/3的磷酸化。　　5、口服100~400mg/kg/day连花清瘟，未能降低乙型流感病毒感染小鼠的死亡率和肺组织病毒载量，可轻微减轻肺组织炎症。　　6、口服10、2mg/kg/day磷酸奥司他韦联合200mg/kg/day连花清瘟与磷酸奥司他韦单独用药相比，明显降低肺组织病毒载量和炎症。　　研究结论：　　1、连花清瘟能抑制乙型流感病毒入侵宿主细胞、NP蛋白的表达和子代病毒的复制。　　2、连花清瘟可能通过抑制IFN-λ1表达，从而抑制JAK-STAT信号通路来调节乙型流感病毒感染的宿主细胞的免疫反应。　　3、连花清瘟联合磷酸奥司他韦可有效抑制乙型流感病毒感染小鼠肺炎，抑制病毒复制。

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