桂郁金挥发油和吉马酮对损伤血管内皮细胞的保护作用及机制研究

摘要

目的：　　研究桂郁金挥发油和吉马酮对缺糖缺氧、H2O2及 ox-LDL诱导损伤的血管内皮细胞的保护作用及机制。　　方法：　　分别建立不同血管内皮细胞损伤模型：①通过使用DMEM F12无糖培养液，并将其放入含95％N2、5％CO2混合气体的缺氧小室中培养6h，从而建立原代BMECs细胞OGD模型。利用MTT法检测细胞增殖率及细胞毒性。②500μmol/LH2O2诱导HUVECs3h，从而建立氧化损伤模型。利用MTT法检测桂郁金挥发油和吉马酮对H2O2损伤HUVECs细胞活力的影响。③通过ox-LDL诱导HUVECs细胞建立细胞损伤模型，利用CCK-8法检测细胞活性。利用HPLC法检测桂郁金挥发油中吉马酮的含量和GC-MS法分析桂郁金挥发油中各成分。利用试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）的活性；硝酸还原酶法检测一氧化氮（NO）；通过酶联免疫（ELISA）法测定细胞中人活化蛋白（APC）、环氧合酶2（COX2）、纤溶酶原激活物（t-PA）和纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）的含量水平和及细胞培养液中内皮素1（ET-1）、前列环素（PGI2）、大鼠6酮前列腺素F1a（6-keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素（IL-6）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的含量水平；利用Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡情况；通过RT-PCR检测细胞中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Caspase-3 mRNA和LOX-1 mRNA的表达并计算Bcl-2/Bax的表达比值。　　结果：　　（1）在一定范围内随着浓度的增大吉马酮对BMECs细胞的增殖作用增强，而超过范围后抑制细胞生长。与模型组比较吉马酮使6-keto-PGF1α，NO，t-PA，SOD，GSH-Px含量增加（P<0.001，P<0.05），PAI-1，ET-1，MDA，LDH含量减少（P<0.01，P<0.05）。　　（2）HPLC法检测桂郁金挥发油中的吉马酮的含量为191.6mg/mL。利用GC-MS法检测出桂郁金挥发油中共有38种成分，其中吉马酮的含量最高占挥发油总含量的37.68%。在20~200μmol/L范围内随着吉马酮浓度的增大被损伤细胞活性不断增强。在0~4μL/mL内随着桂郁金挥发油浓度的增大细胞的抑制率逐渐减少，细胞的活性增强；而增大到一定程度以后，桂郁金挥发油具有一定的细胞毒性。与模型组比较给药组使PGI2， NO，T-NOS，t-PA，SOD，GSH-Px和Bcl-2 mRNA含量增加（P<0.01， P<0.05），PAI-1，ET-1，IL-1，TNF-a，TXB2，MDA，Bax mRNA和Caspase-3 mRNA含量减少（P<0.01，P<0.05）。Hoechst33258荧光染色与正常组比较，模型组细胞膜与细胞核呈浓缩致密的强蓝色荧光，细细胞数量明显减少；与模型组比较，给药组的蓝色荧光强度度降低等。　　（3）100mg/mL ox-LDL培养 HUVECs细胞24h细胞抑制率达到51.1%，适合建立 ox-LDL损伤模型。与模型组比较桂郁金挥发油和吉马酮被ox-LDL诱导后细胞中 t-PA和 APC的含量增加（P<0.01），PAI-1的含量减少（P<0.001）；而细胞培养液中eNOS、NO、PGI2和GSH-Px的含量增加（P<0.01），ET-1、TXB2和LDH的含量减少（P<0.05）；除此之外，高剂量桂郁金还可使被ox-LDL诱导后的细胞中COX2的含量显著减少（P<0.01）。桂郁金挥发油和吉马酮使被ox-LDL诱导后HUVECs细胞中Bax mRNA、Caspase-3 mRNA和LOX-1 mRNA的表达减少，而Bcl-2 mRNA的表达增加，Bcl-2/Bax的比值增大，细胞的凋亡情况缓解。　　结论：　　（1）OGD损伤BMECs细胞使其分泌功能下降，且凝血和纤溶功能出现异常；吉马酮对 OGD损伤BMECs细胞具有保护作用，并调节BMECs细胞的分泌功能及凝血和纤溶功能。　　（2）桂郁金挥发油和吉马酮可能通过抗氧化作用及抑制细胞凋亡等方面，从而对H2O2诱导的脐静脉内皮细胞氧化损伤的具有保护作用。　　（3）桂郁金挥发油和吉马酮可能通过干扰LOX-1、Bcl-2/Bax比值和Caspase-3等凋亡相关基因来抑制血管内皮细胞凋亡，调节抗氧化酶和一些与血管收缩舒张相关的因子等方面，从而对ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤时发挥保护作用。与吉马酮不同的是，桂郁金挥发油高剂量在保护血管内皮细胞时还具有调节COX2的功能。

目录

声明

引言

第一部分 吉马酮对OGD损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

第二部分 桂郁金挥发油和吉马酮对H2O2诱导的脐静脉血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结与讨论

第三部分 桂郁金挥发油和吉马酮对ox-LDL诱导的脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结与讨论

结论

参考文献

中英文缩写词汇表

附录

综述: 吉马酮药理作用的研究进展

致谢

攻读学位期间获得的科研成果

个人简历