以小胶质细胞自身免疫炎症调节切入点探讨DHA在EAE模型小鼠中的药效及分子机制

摘要

背景及目的：　　本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。　　方法和内容：　　1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究　　(1)建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解(RRMS)动物模型和继发进展(SPMS)动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙lmg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观N4,鼠的状态变化。　　(2)砌WS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达　　2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究　　(1)分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1×106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。　　(2)体外培养小鼠巨噬细胞株Raw264.7311小鼠小胶质细胞株BV2,并且体外分离小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)。分别以DHA1,49M为给药低,高剂量和LPS50ng/ml为造模浓度,细胞经过药物处理24h。首先,RT-PCR(Reverse Transcription.Polymerase Chain Reaction)的方法在转录水平上检测Raw264.7和PM细胞中负性免疫共刺激分子PDL1的表达;间接免疫荧光技术检测Raw264.7,BV2和PM三种细胞表面免疫共刺激分子PDL1的蛋白表达水平;采用人外周血白血病T细胞JWkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,通过流式细胞技术检测在共培养体系中,DHA对JurkatT细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。　　(3)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测CCL5的表达;ELISA法检测EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量;趋化实验中,ELISA法检测BV2培养上清中CCL5的含量;transwell法验检测CCL5对小胶质细胞趋化能力变化。　　(4)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测AXL的表达;Western Blot法检测BV2细胞AXL的蛋白表达情况;吞噬试验中,先诱导PC12细胞凋亡,Annexin V-FITC双染法检钡UPC12细胞的凋亡率;间接免疫荧光方法检测BV2细胞对凋亡的PCI2宝m胞的吞噬能力,并且采用荧光显微镜观察BV2细胞对凋亡PC12细胞的吞噬情况。　　3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究　　(1)为了在分子机制水平上验证DHA对AXL的依赖性,我们使用AXL的阻断剂SGl7079(0.2μM)阻断AXL的激活,我们首先采用BV2细胞吞噬凋亡PC12细胞的方法检测BV2细胞吞噬能力的变化;transwell法验检沏JJCCL5对小鼠小胶质细胞BV2趋化能力变化;最后采用Jwkat T与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,间接免疫荧光法检测DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。　　(2)Western Blot法检钡,,UBV2细胞经过DHA和LPS处理后AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达。在上述研究的基础上加入SGI7079作用后,同样检测AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达情况。　　(3)BV2细胞用DHAl和4μM作用24h后,间接免疫荧光方法检测BV2细胞的PDL1,FOXP3,CYSE/F480的表达量,ELISA法检测BV2细胞上清中CCL5的含量,transwell法检测对BV2细胞的趋化能力。BV2细胞用IFN-β和STAT1阻断剂Fludarabine作用后,间接免疫荧光法检测CYSE+/F480+的表达量,Western Blot检测,UPhospho-STAT1,SOCS3,Total-AXL,Phospho-AXL的蛋白表达量。　　结果：　　1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究　　模型验证:MOG35.55造模后,每日疾病评分逐渐增加;行为学步态等指标出现明确障碍。组织学水平和脊髓电镜超显微结构结果显示上伴随有髓鞘脱失。上述结果证明:EAE模型造模成功,满足用于药物评价的实验要求。　　1.1 DHA在EAE小鼠中具有机能改善和神经保护的作用　　RRMS动物模型药效验证:RRMS主要是发病的初期阶段,以中枢神经系统炎症为主并伴随有髓鞘脱失,因此,进行炎症损伤和神经保护检测。与EAE模型组相比,DHA各给药组和MET组能够改善EAE模型小鼠的技能活动障碍。并且在组织学水平上能够对髓鞘起到保护作用。在神经保护作用层面上,DHA中剂量效果明显优于MET组。　　SPMS动物模型药效验证:SPMS是发病的后期,主要是少突胶质细胞失活而导致髓鞘大量的脱失,Olig2则是少突胶质细胞的活性标记物,因此通过检测Olig2的表达来反映少突胶质细胞的活性。与EAE模型组小鼠相比,DHA各给药组和MET组均能够改善EAE模型小鼠的机能活动障碍。组织学水平上,DHA各个剂量组和MET组均能显著提高Olig2的阳性表达率,并且DHA剂量组具有剂量依赖性。　　1.2 DHA能够抑常URRMS4小鼠中枢神经系统炎症　　H&E结果显示DHA和MET均能显著降低脑组织和脊髓组织中的炎症细胞浸润水平;DHA各个给药组和MET组均能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达,相反,抑炎因子IL-10、TGF-β的转录明显激活;同时,DHA重塑炎症反应平衡的活性具有显著的剂量依赖性,并且DHA中,高剂量组均优于MET组。　　2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究　　2.1 基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析　　2.2 DHA自身免疫抗原递呈的药物活性研究　　2.3 DHA对自身免疫炎性趋化的药物活性研究　　2.4 DHA对自身免疫炎症原清除的活性研究　　3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究　　3.1 基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究　　3.2 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究　　3.3 DHA对炎症“促.抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探　　结论：　　1.DHA可以改善EAEd、鼠的运动机能障碍;并且在组织学水平上具有神经保护和调节炎症的作用,进一步缓解EAE模型小鼠的中枢神经系统炎症;　　2.中枢神经系统巨噬细胞及小胶质细胞是DHA在EAE模型中的主要效应细胞,同时小胶质细胞中AXL、CCL5等相关炎症分子的变化构成7DHA发挥药效的主要分子基础;　　3.DHA在中枢神经系统中对自身免疫性炎症的抗原递呈、炎症趋化、抗原清除发挥了系统而多样的调节活性,最终实现了自身免疫炎症反应的平衡重塑和髓鞘保护。分别总结如下:　　(1)DHA可以调节抗原加工递呈过程,降低T细胞对自身抗原的高反应状态。促进免疫共抑制分子PDL1的表面表达,逆转中枢神经系统自身免疫性炎症的过激状态,重塑T细胞(Th17/Treg)炎症促抑平衡。　　(2)DHA可以减少炎性趋化,降低CNS中炎性细胞的募集浸润水平。DHA能显著抑制炎性趋化因子CCL5的表达和分泌,减少炎症损伤部位炎性细胞的浸润,降低炎性细胞的运动趋化能力,进而延缓炎症损伤进展。　　(3)DHA能够增加小胶质细胞对损伤髓鞘的有效清除,促进炎症进程的主动消散。DHA能够显著且特异性的上调吞噬受体AXL的表达,加强病灶内凋亡细胞碎片的清除能力,减少自身免疫炎症原的暴露,削弱炎症反应的诱发水平。　　4.DHA对自身免疫炎症反应的调节活性聚焦于对AXL这一分子靶点的有效调控并依赖于“IFNAR-STAT1-SOCS3”信号通路的高水平活化状态。上述分子机制研究也为DHA治疗自身免疫炎症提供了病理选择性和药效特异性的初步实验提不。

目录

声明

摘要

英文缩略词表(Abbreviation)

文献综述 免疫共刺激分子与自身免疫性疾病

前言

第一章DHA治疗EAE模型小鼠的药效学研究

第一节DHA在EAE模型中具有机能改善和神经保护的作用

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

第二节DHA对EAE小鼠中枢神经系统炎症进展的影响及药效评价

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

第二章DHA在EAE模型中对中枢神经系统自身免疫炎症反应的系统性药理学研究

第一节基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

第二节基于免疫共刺激分子探索DHA对“巨噬细胞-T细胞”相互作用单元所产生的影响的研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

第三节DHA能够通过抑制CCL5来抑制炎症细胞趋化募集

1实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第四节DHA能够增强小胶质细胞的吞噬能力

1．实验材料

2实验方法

1．实验结果

4．讨论

5．结论

第一节基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向—Um的作用机制研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

第二节DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

结语与展望

创新点

参考文献

致谢

附录

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