RNaseL调控肺癌溶骨性转移的生物信息学分析及固本解毒方干预机制初探

摘要

目前，非传染性疾病是全球人群的主要死因，癌症预计成为21世纪阻碍人类期望寿命增长的唯一疾病。肺癌发病隐匿，进展速度快，预后不良，美国的5年生存率约为16％，英国则不到10％，已经成为世界上最致命的恶性肿瘤之一。在中国，男性癌症患者中，肺癌发病率(21.9％)和死亡率(26.4％)均排第一位，在女性癌症患者中，发病率(13.3％)排第二位，仅次乳腺癌，死亡率(11.1％)排第一位，已然成为我国社会发展的重大公共卫生问题。肺癌晚期好发远处转移，骨骼是其常见血行转移靶器官之一。其中，肺腺癌骨转移发生率最高，以溶骨性破坏为主，易继发骨相关事件，严重影响患者的日常生活及生存时间。　　肺癌骨转移的治疗仍面临巨大挑战，大力提倡因病情而异的综合治疗，合理定制个体化治疗方案。寻求疾病的差异基因和诊断的分子标志物，有助于阐明肺癌骨转移的相关分子机制，推动基因靶向治疗的进程。RNase L是体内一种独特的核酸内切酶，被视为细胞增殖和迁移的负调控因子，其突变增加恶性肿瘤的发生风险。研究表明，RNase L在巨噬细胞(破骨细胞前体)中高表达，对破骨细胞分化及凋亡有重要的调控作用。因此，探究RNase L基因在肺癌溶骨性转移发生发展中的潜在机制具有显著意义。　　中医学对肺癌骨转移有着独特而深刻的理论认识，临床复方应用广泛，在整体观念和辨证论治的指导下，理法方药有机结合，实现全方位、分阶段、多靶点的干预，可以贯穿患者治疗的始终。探索中医药抗肺癌骨转移机制一直处于方兴未艾之势，强调与现代医学相结合，进行取长补短，为祖国医学的发展注入新的血液。近些年来，中医药在调控肿瘤转移微环境的优势逐渐凸显，从分子水平不断深入挖掘骨转移机理，从而更好地指导临床应用。通过长期的临床实践，证实固本解毒方治疗的有效性，为骨转移患者减轻痛苦和延长生存期带来福音。因此，探索肿瘤转移微环境对破骨细胞分化的影响，并进行固本解毒方的干预，可能为肿瘤骨转移治疗提供全新思路。　　鉴于此，本研究以RNase L为核心和固本解毒方为干预措施，从不同角度探索肺癌。旨转移潜在的分子机理，主要内容分为两个部分进行:1.基于生物信息学数据库分析RNase L与各种肿瘤之间的潜在关系。2.RNase L调控肺癌溶骨性转移机制初探及固本解毒方的干预作用。　　1.基于生物信息学数据库分析RNase L与各种肿瘤之间的潜在关系　　目的:　　探索RNase L基因在各种恶性肿瘤中的变异及表达情况，构建RNase L蛋白互作网络，进行功能和通路的富集分析，为进一步探究RNase L与肿瘤的潜在关系提供新的方向，为下一步体外细胞实验奠定理论基础。　　方法:　　利用CbioPortal网络平台分析RNase L在TCGA PanCan数据库涉及的所有癌症中出现突变、扩增、缺失等情况，观察RNase L基因变异与肿瘤发生的潜在关系。结合GEPIA在线数据库分析RNase L在所有癌症中的表达水平以及与患者总生存率的关系，找寻与RNase L显著相关的肿瘤。然后，通过STRING进行RNase L蛋白互作分析，构建蛋白质一蛋白质互作网络图。此外，选取互作强度居前10位的互作蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，主要涉及生物学过程、分子功能、细胞学组分以及介导的信号通路。　　结果:　　(1)RNase L基因在大部分肿瘤中均存在基因变异，肺腺癌和肺鳞癌具有多重基因改变，出现频率由高到低的变异依次为增进、扩增、浅缺失、突变。乳腺浸润性癌、肝癌、卵巢癌以扩增为主;子宫癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤以突变为主;子宫颈癌、睾丸癌、胃癌、葡萄膜黑色素瘤以增进为主;肾嫌色细胞癌、肉瘤、头颈部癌、前列腺癌、脑低级别胶质瘤以浅缺失为主;肾乳头状细胞癌以深缺失为主。RNase L蛋白在卵巢浆液性囊腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤中显著低表达，仅在胰腺癌中显著高表达。此外，肾透明细胞癌、脑低级别胶质瘤、卵巢浆液性囊腺癌、间皮瘤和肉瘤的生存率均与RNase L的表达水平呈显著相关。　　(2)RNase L蛋白的相互作用蛋白质由互作强度从强到弱前10位分别为ABCEl、OAS3、OASL、ISGl5、OASl、MXl、OAS2、RSAD2、IRF3和IFITl。GO功能富集分析结果显示:RNase L主要富集I型干扰素效应、病毒基因组复制、病毒生命周期的负调控、病毒防御反应等生物学过程;线粒体基质、真核起始因子复合体、宿主细胞、脂滴等细胞组分;双链核糖核酸结合、腺苷酸转移酶活性、核苷酸转移酶活性、核糖核蛋白复合体结合等分子功能。KEGG通路富集RNase L调控肺癌溶骨性转移的生物信息学分析及固本解毒方干预机制初探分析结果显示:RNaseL主要富集在丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类疱疹病毒、人乳头瘤病毒等病毒感染的通路。Toll样受体信号通路、核苷酸结合寡聚化结构域样受体信号通路、维甲酸诱导基因Ⅰ样受体信号通路等转导途径。　　结论:　　本研究系统分析了RNase L基因变异与各种肿瘤发生发展的潜在联系，并发现RNase L蛋白表达水平与一些肿瘤患者的生存率显著相关。另外，将RNase L的互作用蛋白进行功能注释和通路富集，进一步阐明RNase L与肿瘤发生机制的相关性。本研究结果初步证明，RNase L基因突变增加了肿瘤发生的风险，为临床抗癌治疗提供潜在的分子靶点。　　2.RNase L调控肺癌溶骨性转移机制初探及固本解毒方的干预作用　　目的:　　探讨RNase L基因与固本解毒方对A549细胞增殖和迁移的影响和RNase L基因及肿瘤转移微环境对破骨细胞分化的调控作用。　　方法:　　体外培养A549和A549-RNase L KD细胞，制备固本解毒方含药血清对其进行干预，采用MTT和划痕的实验方法，以吸收光密度值和划痕愈合面积为测量指标，观察RNase L及不同剂量含药血清对肺癌细胞增殖迁移的影响。此外，构建靶向RNase L-shRNA，并转染RAW264.7细胞和A549细胞，经Western Blot法验证其有效沉默RNase L基因，抑制RNase L蛋白的表达。然后，采用Transwell共培养技术，引入外源性RANKL蛋白的方法，建立RAW264.7细胞向破骨细胞分化的模型，以TRAP染色阳性为检测指标进行破骨细胞计数，侧重研究RNaseL和肿瘤转移微环境在破骨细胞分化过程中的作用。　　结果:　　(1)药物类别和细胞种类的不同均会对A549细胞的增殖产生显著的影响，统计分析P＜0.001。在A549正常组及A549 KD组中，中药组和西药组与自身对照组比较均有显著性差异，中药组P＜0.05，西药组P＜0.01。结合抑制率，表明中药和西药均抑制A549细胞的增殖，且西药组效果优于中药组。另外，不同剂量的固本解毒方含药血清的抑制率由高到低排序为:1％＞3％＞5％＞7％＞10％＞13％，进一步表明低剂量中药血清对A549细胞增殖的抑制效果较明显。此外，对于同种含药血清，正常组OD值高于RNase L-KD组，且抑制率低于RNaseL-KD组，分析可得P＜0.01，具有统计学意义。表明RNase L基因可能具有促进A549细胞增殖的作用。　　(2)药物类别和细胞种类的不同均会对A549细胞的迁移产生显著的影响，统计分析P＜0.05。在A549正常及A549 KD中，中药、西药以及对照组三者之间的划痕面积，在0h均无差异，在6h、12h和24h时均产生显著性差异，P＜0.01。结合愈合率，可见含药血清具有抑制A549细胞迁移的作用，抑制作用由强到弱分别为西药＞中药＞对照。此外，在同一时间下，对于同种含药血清，正常组划痕面积值小于RNase L-KD组，且愈合率高于RNase L-KD组，分析可得P＜0.05，表明RNase L基因可能具有促进A549细胞迁移的作用。　　(3)RAW264.7+A549与RAW264.7KD+A549;RAW264.7与RAW264.7KD;RAW264.7+A549KD与RAW264.7KD+A549KD，此3个组间比较均为P＜0.05，说明单核巨噬细胞敲除RNase L基因，抑制破骨细胞的分化。RAW264.7+A549与RAW264.7;RAW264.7+A549KD与RAW264.7;RAW264.7 KD+A549与RAW264.7 KD;RAW264.7 KD+A549 KD与RAW264.7 KD，此4个组间比较均为P＜0.05，说明肿瘤转移微环境促进破骨细胞的分化。RAW264.7 KD+A549与RAW264.7KD+A549KD;R AW264.7+A549与RAW264.7+A549KD，此2个组间比较均为P＞0.05，说明肿瘤细胞敲除RNase L基因，对破骨细胞的分化没有影响。　　结论:　　本研究利用A549、A549-RNase LKD、RAW264.7、RAW264.7-RNase L KD四组细胞系，采用MTT、划痕、Transwell三种实验技术，对其进行固本解毒方的干预，分别以吸收光密度值、划痕面积测量值、破骨细胞计数值为指标，实验结果初步证实了RNase L在一定程度上可以促进A549细胞的增殖和迁移，固本解毒方可以抑制A549细胞的增殖和迁移，且以低剂量效果为佳。另外，RNase L和肿瘤转移微环境均不同程度地促进了破骨细胞分化。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

第一部分文献综述

综述 肺癌骨转移的中西医认识及治疗进展

参考文献

第二部分生信分析

前言

第一章基于TCGA数据库分析RNase L基因与肿瘤的潜在关联

2研究结果

第二章基于STRING数据库分析RNase L蛋白的蛋白质互作网络

1材料与方法

2研究结果

第三章基于GO和KEGG数据库进行RNase L互作蛋白的富集分析

1材料与方法

2研究结果

讨论

参考文献

第三部分实验研究

前言

第一章A549和RAW264.7细胞培养与RNase L基因敲除的验证

1实验材料

2实验方法

3实验结果

第二章含药血清的制备

1实验材料

2实验方法

第三章RNase L对A549细胞增殖的影响及固本解毒方的干预

第一节不同剂量的固本解毒方对A549细胞增殖的影响

第二节中西药含药血清及RNase L对A549细胞增殖的影响

第四章RNase L对A549细胞迁移的影响及固本解毒方的干预

1实验材料

2实验方法

3实验结果

第五章RNase L及肿瘤转移微环境对破骨细胞分化的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

讨论

参考文献

结论

致谢

个人简历