天葵子总生物碱化学成分及对肿瘤炎性微环境的干预作用研究

摘要

目的：　　天葵子为毛莨科唐松草亚科耧斗菜族天葵属天葵Semiaquilegia adoxoides(DC.)Makino的干燥块根，收载于2015版《中国药典》一部，味甘、苦、性寒，归肝、胃经。功效清热解毒，消肿散结，用于痈肿疗疮，乳痈，瘰疬，蛇虫咬伤。天葵子中主要活性成分为生物碱类，目前己从天葵子中分离得到各种成分60余种，主要包括唐松草酚定、木兰碱、小檗碱等。天葵子是临床常用中药，疗效确切，但目前国内尚未见对天葵子生物碱抗肿瘤机制研究的报道，其抗肿瘤药效物质基础及作用机制尚不清楚。　　肿瘤微环境，是肿瘤细胞存活的主要内在环境，其中包括肿瘤、免疫、炎性等多种细胞，也包括细胞间质、微血管以及浸润在其中的生物分子。肿瘤微环境包含许多环节，细化可区分为炎性微环境、血管微循环微环境、迁移微环境和免疫抑制微环境等。其中炎性微环境是肿瘤微环境中的重要组成部分之一，可加速乳腺癌的发生发展、促进血管生成和转移，破坏适应性免疫反应形成免疫逃逸，导致耐药形成。因此炎性微环境是乳腺癌治疗中重要的研究方向。　　中医理论认为，肿瘤发展全程伴随存在的痰、浊、瘀、热等病理因素，与肿瘤微环境中存在的炎性细胞、炎性因子有相似的作用，这些病理因素会影响机体正常的生理功能，加速肿瘤发展进程。中医药在肿瘤的治疗中具有一定的疗效优势，在“癌毒”理论指导下，针对肿瘤痰、浊、瘀、热的病理因素，中医药可以从多方面调整肿瘤微环境的构成，改善局部炎性微环境，并通过抑制血管新生、诱导肿瘤细胞凋亡、改善细胞信号通路及传导等方式抑制肿瘤生长[1]。早期乳腺炎、乳腺增生和乳腺癌的发生关系密切，有研究表明乳腺增生是乳腺癌的病理基础[2]，表明乳腺炎、乳腺增生等疾病与乳腺癌在发病过程中关系十分密切。天葵子在治疗乳腺增生、乳腺炎等乳腺疾病方面效果显著，因此应用天葵子干预调整乳腺癌炎性微环境可能是其治疗乳腺癌的重要机制。　　因此为更加深入阐明天葵子总生物碱部位的化学成分及其抗肿瘤机制，我们对天葵子的化学成分、抗肿瘤活性及机制进行了如下研究。　　方法：　　本研究采取以下方法对天葵子总生物碱抗肿瘤的药效及机制进行研究。　　1.对天葵子70％乙醇提取物进行了化学成分研究，采用反相柱层析分离手段分离得到13个化合物，采用波谱技术鉴定了6种生物碱成分，分别为木兰碱，天葵碱，唐松草酚定，N-methylcorydine，tembetarine和紫藻块茎碱。　　2.对天葵子总生物碱抗肿瘤药效进行研究，采用S180小鼠肉瘤细胞细胞体内模型初步验证了天葵子总生物碱的抗肿瘤活性及体外对三种人源乳腺癌瘤株的抑制作用。　　3.对天葵子总生物碱体外干预肿瘤炎性微环境进行研究，采用PMA诱导的肿瘤相关巨噬细胞为研究对象，测定肿瘤炎性微环境中TGF-β，TNF-α，IL-6的含量，研究天葵子总生物碱对乳腺癌炎性微环境中炎性因子水平的影响。　　4.对天葵子总生物碱处理后肿瘤细胞及微环境中相关蛋白表达的影响进行研究，采用Westem-Blot法检测MDA-MB-231细胞中炎性相关通路NF-κB、STAT3、SMAD-4蛋白的表达水平，研究天葵子总生物碱对乳腺癌炎性微环境干预作用的可能机制。　　结果：　　1.S180实体瘤抑瘤率实验结果表明，天葵子总生物碱高剂量组(给药量为200mg·kg-1)抑瘤率达45.24％。TKZ给药组荷瘤小鼠的脾指数、胸腺指数与模型组相比无影响，结果无显著性差异(P＞0.05)，说明TKZ高、中剂量组虽然抑瘤率低于环磷酰胺组，但其可能具有提高小鼠免疫力的潜在功能。　　2.对炎性微环境影响实验表明，天葵子总生物碱60μg·mL-1组给药36h可以明显降低肿瘤炎性微环境中促炎因子TNF-α及IL-6的表达，促进TGF-β的表达(P＜0.05)，说明天葵子总生物碱可以通过调控炎性因子表达水平干预肿瘤炎性微环境。　　3.天葵子总生物碱对NF-κB、STAT3、SMAD-4蛋白表达水平的影响表明，天葵子可以降低肿瘤中炎性蛋白的表达。　　结论：　　本研究对天葵子总生物碱部位进行了提取和富集，并对其中的化学成分进行了分离，通过波谱手段鉴别了其中6种生物碱类成分，一种为小檗碱类，另外五种为苄基异喹啉生物碱，其中N-methylcorydine、紫堇块茎碱和tembetarine均为首次从天葵子中分离得到。　　本研究通过体内体外实验初步验证了天葵子总生物碱对肿瘤具有明确抑制作用，并且对荷瘤小鼠的免疫器官无明显影响。结合天葵子治疗乳腺炎的临床效，我们通过实验进一步验证了天葵子对炎性微环境的干预调节作用。研究结果表明，天葵子总生物碱可以降低促炎因子的分泌，促进抑癌因子的表达。为阐明天葵子干预肿瘤炎性微环境的机制，我们研究了天葵子总生物碱给药后肿瘤细胞及肿瘤炎性微环境中相关蛋白的表达。研究结果表明天葵子总生物碱可以降低促癌相关蛋白的表达，促进抑癌蛋白的表达。综上天葵子抗肿瘤的有效部位为天葵子总生物碱，其抗肿瘤药效显著。其抗肿瘤药效机制可能与干预肿瘤炎性微环境，调控炎性因子表达以及相关蛋白的表达有关。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

前言

1．1．1天葵子的本草考证

1．1．2天葵子化学成分研究现状

1．2天葵子的药理作用及临床应用

1．2．1天葵子的药理作用

1．2．2天葵子的临床应用

1．3乳腺癌的中医证型及分子分型

1．3．1中医对乳腺癌的病因及中医证型

1．3．2乳腺癌的分子分型

2实验部分

2．1天葵子总生物碱化学成分研究

2．1．1实验材料与仪器

2．1．2实验过程

2．1．3化合物的结构解析

2．1．4讨论

2．2天葵子总生物碱抗肿瘤活性初步研究

2．2．1材料、仪器与试剂

2．2．2实验步骤

2．2．3结果分析

2．2．4讨论

2．3天葵子总生物碱对炎性因子表达的影响

2．3．1材料、仪器与试剂

2．3．2实验步骤

2．3．3结果分析

2．3．4讨论

2．4天葵子总生物碱对相关蛋白表达的影响

2．4．1材料、仪器与试剂

2．4．2实验步骤

2．4．3结果分析

2．4．4讨论

3．1研究总结

3．2研究局限

3．3展望

参考文献

致谢

个人简介

附图

附表