两个沙棘品种果实抗氧化物质积累差异机制

摘要

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)属胡颓子科沙棘属，是一种多年生落叶灌木、小乔木或乔木，在中国分布广泛。沙棘果实含有丰富的生物活性物质，具有良好的抗氧化能力。抗氧化能力是评价果实品质的重要指标，目前对沙棘果实抗氧化能力的研究，多集中在对不同品种沙棘果实抗氧化能力的测定，但对于造成不同品种不同生长时期沙棘抗氧化能力差异的原因尚不清楚。　　本研究选择抗氧化能力差异大的两个沙棘品种(中国沙棘‘丰宁’和蒙古沙棘‘向阳’)果实为材料，对沙棘果实抗氧化能力与主要抗氧化物质的关系进行了研究。主要测定了沙棘果实抗氧化能力、总酚含量、类黄酮含量、原花青素含量以及单宁含量，并对抗氧化能力与其他各个生理指标进行了相关性分析。同时采用UPLC-MS和RNA-Seq技术分别对两个品种三个不同生长时期沙棘果实的代谢物质和转录本进行了分析，并结合生理数据，寻找影响两个品种沙棘果实抗氧化能力显著差异的代谢物质、代谢途径及其代谢途径中的关键基因。重点分析沙棘糖基转移酶基因家族的结构和功能，筛选获得沙棘中的类黄酮糖基转移酶，并对相应基因进行了原核蛋白表达。　　沙棘果实生理数据测定结果显示，丰宁果实的抗氧化能力、总酚含量、类黄酮含量、原花青素含量以及单宁含量明显高于向阳果实，沙棘果实中的酚类物质主要包括类黄酮和原花青素，其含量与沙棘果实抗氧化能力具有显著正相关关系。沙棘果实代谢组分析结果显示，在沙棘果实发育的三个不同阶段，丰宁果实中有23种代谢物质均显著高于向阳果实，23种差异代谢物中有13种属于酚类物质，而13种酚类物质中有11种属于类黄酮，11种类黄酮代谢物中有7种是以类黄酮糖基衍生物的形式存在。对沙棘果实转录组中差异基因和生理数据进行WGCNA分析，挑选出了4个显著相关的共表达模块。对这4个共表达模块进行GO和KEGG通路分析，结果显示丰宁果实中与类黄酮代谢有关的基因表达显著高于向阳果实。表明类黄酮代谢相关基因的差异表达，影响了两个品种沙棘果实中类黄酮含量的差异。通过对沙棘果实中糖基转移酶基因的结构以及功能分析，结果发现有13个糖基转移酶基因可能参与类黄酮糖基衍生物的合成，对其中两条基因成功进行了蛋白原核表达。　　本研究发现，沙棘丰宁果实的抗氧化能力显著高于向阳果实，而沙棘果实中的酚类物质尤其是类黄酮物质是造成两个品种抗氧化能力差异的重要原因。而两沙棘品种果实中类黄酮含量差异，一方面是由类黄酮代谢途径中的相应催化酶基因的表达差异所造成，另一方面是由于类黄酮糖基转移酶基因催化生成了相应的类黄酮糖昔衍生物，从而丰富了沙棘果实中类黄酮的种类，影响了类黄酮含量的积累。研究阐述了酚类物质尤其是类黄酮对沙棘果实抗氧化能力的影响并对其分子机制进行了探究，对于沙棘的分子育种以及优良品种的选择具有重要指导意义。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1．1研究背景、目的、意义

1．2国内外研究现状

1．2．1植物体内重要的抗氧化物质：酚类

1．2．2糖基转移酶

1．3研究目标和主要研究内容

1．3．1研究目标

1．3．2研究内容

1．3．3技术路线

第二章两个品种沙棘果实中酚类物质含量及抗氧化能力测定

2．1材料与方法

2．1．1沙棘果实试验材料

2．1．2试验试剂、仪器

2．1．3试验方法

2．2结果与分析

2．2．1待测物标准方程建立

2．2．2两个品种沙棘果实在不同发育阶段中总酚、类黄酮、原花青素含量以及总抗氧化能力差异

2．2．3沙棘果实总抗氧化能力与总酚、类黄酮、原花青素、单宁含量的相关性关系

2．3小结

第三章两个品种沙棘果实酚类物质的UPLC-MS鉴定

3．1材料与方法

3．1．1沙棘果实试验样品

3．1．2试验试剂

3．1．3试验方法

3．1．4数据分析方法

3．2结果与分析

3．2．1代谢物定性定量分析

3．2．2样本质控分析

3．2．3沙棘不同发育阶段两个品种果实的代谢组PLS-DA和差异代谢物分析

3．3小结

第四章两个品种沙棘果实的转录组分析

4．1材料与方法

4．1．1沙棘果实试验样品

4．1．2转录组测序

4．1．3测序数据质量评估与筛选

4．1．5序列比对

4．1．6表达量分析及差异基因挑选

4．1．7加权基因共表达网络分析及基因功能分析

4．2结果与分析

4．2．1沙棘果实测序数据质量评估结果

4．2．2样品间相关性检查结果

4．2．3差异基因挑选结果

4．2．4共表达分析(WGCNA)结果

4．2．5 GO及KEGG通路分析结果

4．2．6 qRT-PCR定量验证结果

4．3小结

第五章类黄酮糖基转移酶表达

5．1材料与方法

5．1．1试验样品

5．1．2序列分析

5．1．3基因克隆

5．1．4载体构建

5．1．5转化

5．1．6蛋白诱导表达

5．1．7蛋白纯化

5．1．8蛋白评估

5．2结果与分析

5．2．1序列分析

5．2．2基因克隆与载体连接

5．2．3蛋白表达与纯化

5．2．4蛋白评估结果

5．3小结

第六章结论与展望

6．1讨论

6．2主要结论

6．3展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢