木姜子属落叶组植物系统进化和叶片化学指纹图谱研究

摘要

樟科(Lauraceae)木姜子属（Litsea Lam.）植物是一个分布广泛，用途多样，生态及经济价值显著的木本植物类群，目前全世界发现的该类植物己超过200种，主要在热带以及亚热带地区分布，中国约有72种。该属的落叶组(Sect.Tomingodaphne)植物在工业用油、药用以及精油开发利用上具有重要的研究和应用价值，其中山鸡椒(Litseacubeba(Lour.)Pers.)、毛山鸡椒（Litsea cubeba var.formosana）和毛叶木姜子(Litsea mollisHemsl.)果实中提取的精油广泛用于中药品、天然香料、化妆品、生活用品等的添加剂。但属内落叶组植物形态相近，功能相似，各物种亲缘关系和系统分类位置仍是未解之谜，这严重阻碍了该属落叶组植物有效的开发和利用。因此，迫切需要对木姜子属落叶组植物的亲缘关系和化学成分进行系统研究，为其深度开发利用提供科学数据。本研究主要以木姜子属落叶组植物为研究对象，利用形态学和分子系统学方法研究该属落叶组植物的分类体系;通过构建化学指纹图谱分析各物种化学成分的异同，并进一步筛选出几种具有重要应用价值的木姜子属落叶组植物进行研究，主要研究结果如下:　　(1)木姜子属落叶组植物形态学鉴定。对木姜子属落叶组植物进行全分布区范围内采样，并制作完成了15种木姜子属落叶组植物腊叶标本，所有标本保存于中国林业科学研究院亚热带林业研究所。形态学分析结果表明，根据叶柄都在2cm以上，天目木姜子（Litsea auriculata Chien et Cheng）和杨叶木姜子(Litsea populifolia(Hemsl.)Gamble)划分为一组;根据小枝无毛，山鸡椒、红叶木姜子（Litsea rubescens Lec.）、宜昌木姜子（Litseaichangensis Gamble）和高山木姜子（Litsea chunii Cheng）划分为一组;根据小枝和叶片被短柔毛，将四川木姜子（Litsea moupinensis var.szechuanica）、宝兴木姜子（Litseamoupinensis Lec.）、毛山鸡椒、峨眉木姜子（Litsea moupinensis var.glabrescens）和毛叶木姜子划分为一组;根据小枝和叶片被长绢毛，将木姜子（Litsea pungens Hemsl.）、绢毛木姜子(Litsea sericea(Nees)Hook.f.)和钝叶木姜子（Litsea veitchiana Gamble）划分为一组。　　(2)木姜子属落叶组植物系统进化分析。利用SNP差异位点和叶绿体基因组序列对16种木姜子属落叶组植物、2种平托组(Sect.Conodaphne)植物、2种杯托组(Sect.Cylicodaphne)植物和1种檫木属植物构建系统进化树。两种方法建立的系统发育树都表明天目木姜子的系统位置特殊，打破了天目木姜子从形态分类上归为落叶组的传统认识，分子系统发育分析表明，天目木姜子与平托组和杯托组植物亲缘关系更近，可能是木姜子属落叶组植物与常绿树种的过渡树种，提示天目木姜子在木姜子属植物进化中居特殊地位;结果支持果托特征可作为木姜子属内物种划分的重要依据。此外，山鸡椒、毛山鸡椒和毛叶木姜子单独聚类到一支，且进化速率最快;毛叶木姜子和毛山鸡椒亲缘关系更近，这与形态学研究存在差异。　　(3)木姜子属落叶组植物叶片挥发油化学指纹图谱分析。通过GC-MS法对12种木姜子属落叶组植物新鲜叶片进行挥发性成分检测，共鉴定出16种主要成分。基于各成分含量进行聚类分析，结果显示天目木姜子化学成分与该属落叶组其他物种差异较大，这与形态分类及系统进化分类结果一致;峨眉木姜子、四川木姜子和宝兴木姜子化学成分相近，这与形态学分类结果一致;在系统分类中聚为一支的毛叶木姜子、毛山鸡椒和山鸡椒化学成分类似，多样性最为丰富;此外，杨叶木姜子叶片芳樟醇含量最高。通过生长速率法和抑菌圈法测定木姜子属落叶组山鸡椒、毛叶木姜子和毛山鸡椒精油分别对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.fordii l）、大肠杆菌（Escherichia coli）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抑菌活性，结果表明鸡椒精油含量最高且对尖孢镰刀菌、大肠杆菌和李斯特菌的抑菌效果都优于毛叶木姜子和毛山鸡椒。柠檬醛和芳樟醇含量与精油抑菌活性呈显著正相关。　　(4)木姜子属落叶组杨叶木姜子遗传多样性探究。杨叶木姜子是属内芳樟醇含量最高的物种，极具开发潜力。以四川盆地西南边缘峨眉山地带的杨叶木姜子为材料，在峨眉山全分布区内根据地理位置和海拔高度差异选择7个不同区域采集到84个样本，利用简化基因组测序(GBS)技术对其进行遗传多样性分析。通过系统进化树分析、主成分分析和群体结构分析均显示7个杨叶木姜子居群聚类到3大群体，表明峨眉山区地理差异是造成遗传多样性的主要因素;3个群体平均观测杂合度(Ho)为0.27218，平均期望杂合度(He)为0.20635;群体内变异百分率达到96.28％。表明变异主要为群体内变异。研究结果为杨叶木姜子遗传育种、物种多样性保护及开发利用提供依据。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1．1研究背景

1．1．2国内外研究现状及评价

1．2研究目标和主要研究内容

1．2．1关键的科学问题与研究目标

1．2．2主要研究内容

1．3研究技术路线

第二章木姜子属落叶组植物形态学鉴定

2．1材料与方法

2．1．1木姜子属落叶组植物样品采集

2．1．2植物腊叶标本的制作

2．2实验结果

2．2．1木姜子属落叶组植物形态鉴定

2．2．2木姜子属落叶组植物检索表

2．3本章小结

第三章木姜子属落叶组植物亲缘及进化关系探究

3．1材料与方法

3．1．1实验材料

3．1．2样品基因组DNA提取与检测

3．1．3构建DNA文库与测序

3．1．4数据质控

3．1．5测序reads与参考基因组比对

3．1．6变异检测和注释

3．1．6 SNP系统发育树构建

3．1．7叶绿体基因组拼接与系统发育树构建

3．2结果与分析

3．2．1样品DNA提取及检测结果

3．2．2测序数据质量评估

3．2．3测序结果与参考基因组比对分析

3．2．4全基因组遗传变异结果分析

3．2．5木姜子属落叶组植物系统发育分析

3．3本章小结

第四章木姜子属落叶组植物化学指纹图谱研究

4．1材料与方法

4．1．1样品采集与处理

4．1．2气相色谱质谱联用仪(GC-MS)挥发性成分检测

4．1．3叶片化学成分分析

4．1．5聚类分析

4．1．6山苍子精油抑制真菌活性测定

5．1．7山苍子精油抑制细菌活性测定

5．1．8数据分析

4．2结果与分析

4．2．1叶片GC-MS检测

4．2．2叶片挥发性成分鉴定

4．2．2木姜子属落叶组植物叶片挥发油化学指纹分析

4．2．3木姜子属落叶组植物叶片挥发油化学成分聚类分析

4．2．4山苍子精油对真菌的抑菌性评估

4．2．5三种山苍子精油抑菌活性评价

4．2．6山苍子精油化学成分分析

4．2．7山苍子精油主要成分与抑菌效果相关性分析

4．3本章小结

第五章杨叶木姜子遗传多样性分析

5．1材料与方法

5．1．1样品采集与处理

5．1．2样品总DNA提取与检测

5．1．3基因组GBS文库构建及测序

5．1．4数据统计与分析

5．2结果与分析

5．2．1 DNA样品制备及GBS文库构建

5．2．2 SNP检测与注释

5．2．3群体遗传结构分析

5．2．4群体遗传多样性分析

5．3本章小结

第六章结论与展望

6．1结论

6．1．1木姜子属落叶组植物分子系统进化关系

6．1．2木姜子属落叶组植物叶片化学指纹图谱分析

6．2讨论

6．3展望

附录

参考文献

在读期间的学术研究

致谢