玉米ZmMYB59转录因子的亚细胞定位、启动子功能鉴定及在烟草中的表达分析

摘要

种子能否顺利出土萌发直接关系到农业生产是否获得丰收，研究种子萌发性状对促进农业生产具有重要意义。为探讨玉米MYB转录因子基因Zm MYB59在种子萌发中的功能，前期构建pCAMBIA3301-ZmMYB59-Bar植物过表达载体转化烟草，并分析了ZmMYB59基因在不同播深及萌发过程中的表达情况。本文通过构建植物表达载体，经转化和鉴定获得阳性转基因水稻植株，对ZmMYB9基因的启动子功能进行了鉴定;对ZmMYB59基因表达的蛋白进行了定位;对ZmMYB59转基因烟草T2代种子在逆境胁迫下的发芽率、发芽势、活力指数、SOD、POD、CAT、APX酶活性及MDA、Pro、叶绿素含量进行了分析。研究结果表明:　　1.ZmMYB59基因所表达的蛋白的亚细胞定位研究　　从玉米自交系B73中克隆得到ZmMYB59基因，构建了35S ZmMYB59-EYFP的融合表达载体，进行该基因的亚细胞定位分析。日本晴水稻原生质体瞬时表达系统的研究结果表明:ZmMYB59蛋白定位于细胞核。　　2.ZmMYB59基因的启动子缺失研究　　克隆ZmMYB59基因起始密码子前1000bp和2000bp，2个启动子片段分别命名为MYB59-P、MYB9-P-2，构建GUS植物表达载体pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K，并通过农杆菌介导法转化日本晴水稻获得GUS植物表达载体转基因植株。可经过GUS染色法观察外源基因的时空表达模式，预测ZmMYB59基因启动子中重要的motif。分别对转pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K的T1代种子、萌发期和苗期的根、茎、叶进行GUS染色，GUS染色结果表明:pCXGUS-MYB-1K的种子没有着色，pCXGUS-MYB-2K的种子胚乳边缘着色;种子萌发期pCXGUS-MYB-1K只有芽尖着色，pCXGUS-MYB-2K芽尖和根均着色，芽尖着色较深，根维管束细胞少量着色;苗期pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K植株的根、茎、叶均能着色。推测ZmMYB59基因的启动子可能是组成型启动子，同时也说明MYB59-P是启动子发挥正常调控功能所必须的;而后者的根、茎、叶染色均比前者深，说明MYB59-P启动能力不强，推测MYB59-P-2中可能存在增强启动子表达的顺式作用元件。　　3.ZmMYB59基因在T2代转基因烟草中的功能分析　　对ZmMYB59基因过表达T2代烟草种子1cm播深（沙子）下的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及根长、苗高、叶宽;1.5％NaCl、8％PEG和1cm播深下的SOD、POD、CAT、APX酶活性和MDA、Pro、叶绿素含量进行分析，结果表明:在1cm播深发芽实验中转基因烟草与野生型烟草相比发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、鲜重都显著降低，其中发芽率、活力指数、鲜重达到极显著差异;1cm播深30d后转基因烟草与野生型烟草相比根长、苗高、叶宽显著降低，苗高和叶宽达到极显著差异。1.5％NaCl处理48h后的过表达烟草与野生型烟草相比，SOD、POD、CAT和APX酶活性显著降低，Pro含量极显著降低，MDA含量显著升高;8％PEG处理48h后的过表达烟草与野生型相比，CAT、POD酶活性极显著降低，SOD酶活性显著降低，APX酶活性、Pro含量降低但不显著，叶绿素含量极显著升高;1cm播深处理48h后过表达烟草与野生型相比，CAT、POD、APX酶活性显著降低，SOD酶活性极显著降低，Pro含量极显著降低，MDA含量升高但不显著。胁迫处理后，过量表达ZmMYB59基因显著降低了烟草ROS清除酶活性，而MDA含量升高，表明ZmMYB59在萌发、干旱、盐胁迫中可能是一个负调控转录因子。　　以上研究结果为揭示MYB转录因子调控种子萌发的分子机理提供科学依据，对促进种子萌发性状的遗传改良具有重要的参考价值。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物MYB转录因子的亚细胞定位

1．2 植物基因启动子的研究

1．2．1 植物启动子的概念及基本结构

1．2．2 植物启动子的分类及其应用进展

1．3 植物MYB转录因子的研究

1．3．1 植物MYB转录因子在种子萌发中的作用

1．3．2 植物MYB转录因子在逆境胁迫中的功能

1．3．3 植物MYB转录因子在逆境胁迫中ROS的清除机制

1．4 本文研究的目的和意义

第二章 ZmMYB59的亚细胞定位研究

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验常用试剂及试剂盒

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 常用试剂及培养基的配制

2．2 实验方法

2．2．1 玉米ZmMYB59基因的克隆

2．2．2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化

2．2．3 重组质粒的鉴定

2．2．4 ZmMYB59基因亚细胞定位载体的构建

2．2．5 日本晴水稻的转化

2．3．1 玉米ZmMYB59基因的克隆

2．3．2 亚细胞定位载体35S∷ZmMYB59-EYFP的构建

2．3．3 融合表达载体35S∷ZmMYB59-EYFP转化水稻原生质体的检测

2．4 讨论

第三章 ZmMYB59锣基因的启动子缺失研究

3．1 实验材料与设备

3．1．1 研究材料

3．1．2 实验常用试剂和试剂盒

3．1．3 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 培养基的配制

3．2．2 常用试剂及溶液的配制

3．2．3 水稻基因组DNA的提取

3．2．4 启动子序列的分析

3．2．5 引物设计及相关的PCR扩增

3．2．6 琼脂糖凝胶回收DNA

3．2．7 酶切及连接反应

3．2．8 农杆菌EHA105感受态细胞的制备及转化

3．2．9 水稻胚性愈伤转化

3．2．10 转基因苗的分子鉴定

3．2．11 GUS组织化学染色

3．3．1 ZmMYB59基因启动子片段的克隆

3．3．2 载体的构建及启动子MYB59-P，MYB59-P-2的生物信息学分析

3．3．3 水稻胚性愈伤转化

3．3．4 转基因植株的PCR检测

3．3．5 转基因水稻各组织GUS活性检测

3．4 讨论

第四章 ZmMYB59在T2代转基因烟草中的功能分析

4．1 实验材料

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验设备

4．2 实验方法

4．2．1 种子萌发

4．2．2 材料的处理

4．2．3 各个生理指标的测定

4．2．4 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 T2代转基因烟草种子活力相关指标分析

4．3．2 表型统计分析

4．3．3 酶活力测定

4．3．4 转基因后对烟草胚轴细胞的影响

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

缩略语词汇表

个人简介

致谢