中华眼镜蛇细胞毒素基因克隆、表达及对肿瘤细胞作用机理的研究

摘要

蛇毒主成份为具有多种生物活性的蛋白和肽类的混合物。一些蛋白作为神经毒素、细胞毒素和组织坏死性诱导剂而具有致死效应，另外一些可引起多种不同的药理学反应，且毒性较低。所有这些蛋白毒素均可攻击细胞上某些特定的位点而影响生理进程。中华眼镜蛇细胞毒素(Cardiotoxin，CTXs)为一类可与细胞膜作用的碱性多肽，主要通过结合于细胞膜表面磷脂或膜蛋白引发多种药理效应。近年来，纯化的各种眼镜蛇细胞毒组分已广泛用于实体瘤和血液病的治疗研究。 本论文旨在研究细胞毒素组分三(CTXⅢ)的克隆、表达和纯化，重组细胞毒素活性分析以及细胞毒素作为临床抗肿瘤药物的可行性研究。主要包括以下三部分内容： 1、研究了CTXⅢ的理化性质，并测定了N端15个氨基酸残基序列，克隆得到CTXⅢ基因。将其分别装入两种原核E.coli表达载体和真核酵母表达载体中进行表达。CTXⅢ在pET30a载体中表达时，在胞内形成包涵体，以不可溶的形式存在。CTXⅢ基因插入pThioHisB载体中，与硫氧还蛋白(Trx)融合表达，通过肠激酶位点裂解可将融合蛋白释放出来。在实验室规模，每升培养液可表达7mg重组心脏毒素，经Histrap柱纯化回收，得率可达75％，肠激酶裂解后凝胶柱回收率为70％，总回收率达37％左右。CTXⅢ基因插入真核酵母分泌型表达载体(PIC9K)，经诱导重组蛋白表达量为9.5mg/L，培养液经离心后直接凝胶柱回收重组目的蛋白，得率可达65％。与天然毒素相比，重组蛋白N端冗余三个氨基酸(Gly-Tyr-Thr)，RP—HPLC分析重组蛋白纯度大于95％。利用溶血活力和对K562肿瘤细胞增殖抑制检测重组细胞毒素与天然细胞毒素的活性，溶血分数50％时所对应的质量浓度(HU50)分别为6.53μg／ml和7.4μg/ml，12小时IC50分别为3.56μg/ml和2.63μg/ml，表明重组蛋白活性接近天然蛋白，推测分泌表达时重组蛋白折叠正确。选择真核酵母分泌型表达载体为最佳表达方式。 2、采用不同生物学方法分析细胞毒素体外作用于血液病细胞K562的杀伤效果，通过细胞增殖抑制、AnnexinV/PI双染实验、Caspase活性检测和DNA片段化等观察CTXⅢ诱导下K562细胞凋亡的情况。结果显示，CTXⅢ作用于K562细胞可使细胞停滞于G2/M期，并且活化Caspase—8和细胞色素C双重信号途径，诱导下游Bid分子切割，促使K562细胞发生凋亡。MAPK特异性阻断剂和免疫印迹分析发现，CTXⅢ诱导K562细胞凋亡的过程中，通过磷酸化p38和JNK蛋白，激活MAPK信号通路。建立鸡胚尿囊膜(CAM)体内K562肿瘤模型实验，高剂量CTxⅢ不影响鸡胚发育，表明CTXⅢ基本无毒副作用，CTXⅢ亦可有效抑制CAM上K562细胞形成肿瘤结节的增长，这一过程与Caspase—8和细胞色素C途径相关。通过分析K562血液病的形成机制，认为CTXⅢ可能是通过竞争性结合ATP，从而阻断K562细胞中异常酪氨酸激酶活性。 3、本论文同时分析了CTXⅢ作用于实体瘤肝癌的应用效果，在较低剂量下，CTXⅢ可有效抑制HepG2细胞增殖(24小时的IC50=2.58μg/ml)，但对Bel—1402无明显作用。进一步研究发现，DAPI染色、AnnexinV/PI双染实验和DNA片段分析证明CTXⅢ促使细胞发生凋亡，其凋亡过程受死亡受体途径和线粒体途径两种机制调控。CTXⅢ的作用早期HepG2细胞周期停滞于S期，半定量PCR和免疫印迹实验发现，周期素蛋白CyclinD1、CyclinA和CyclinE在转录和翻译过程中，其蛋白和mRNA水平均有所下调，Bcl—2/Bax的蛋白和mRNA比例亦均发生变化。尾静脉注射CTXⅢ引起小鼠快速死亡，LD50为936.7±38μg/kg。建立体内裸鼠HepG2肿瘤模型，经口服给药结果表明，CTXⅢ(2mg/kg/d)可明显抑制肿瘤生长，其抑瘤率可达39.4％。病理检查心、肝、脾、肺、肾及小肠等脏器，未发现出血或坏死，表明CTXⅢ经口服对动物体基本无毒副作用。 综上所述，CTXⅢ体内、外作用均可有效的抑制肿瘤细胞(K562、HepG2)的增殖，真核酵母表达产生的重组细胞毒素表现出与天然毒素类似的生物活性，因此，利用重组表达技术，不仅为蛇毒抗肿瘤药物提供来源，而且为研究三指蛋白的结构——功能关系提供了丰富的素材。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1中华眼镜蛇细胞毒素的研究进展

1.1中华眼镜蛇细胞毒素的药理作用

1.2眼镜蛇细胞毒素抗肿瘤作用的机理

1.3眼镜蛇细胞毒素的结构特点

1.4 眼镜蛇细胞毒素的功能位点

1.5细胞毒素的基因工程研究现状

2研究背景、意义和技术方案

2.1研究背景和意义

2.2实验方案

3参考文献

第二章中华眼镜蛇细胞毒素的克隆表达及纯化

第一节天然中华眼镜蛇细胞毒素理化性质研究及序列测定

1材料及仪器

2实验方法

3实验结果与讨论

4小结

第二节中华眼镜蛇细胞毒素的克隆及在原核载体中的表达

1中华眼镜蛇细胞毒素基因克隆

2克隆入pET30a载体表达细胞毒素

第三节克隆入融合表达载体pThioHis B及融合蛋白的诱导表达

1表达载体的构建

2细胞毒素融合蛋白的诱导表达

3融合蛋白的渗透休克释放

4细胞毒素在pThioHis B中的融合表达

第四节细胞毒素在毕赤酵母中的诱导表达及纯化

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4小结

5讨论

6参考文献

第三章细胞毒素抗肿瘤活性研究

第一节细胞毒素抑制人粒细胞白血病K562的体内外实验研究

1细胞毒素的体外抗K562细胞作用机理研究

2天然细胞毒素体内抗K562细胞的研究

3讨论

第二节细胞毒素抑制人肝癌HEPG2细胞的体内外实验研究

1细胞毒素体外抗肝癌(HepG2)细胞生物活性研究

2细胞毒素体内抗肿瘤作用研究

3小结

4讨论

5参考文献

致谢

附录 攻读博士学位期间发表的论文及获得的奖励

发表论文一

发表论文二

发表论文三