人类nectin-2蛋白V结构域的晶体结构和功能研究

摘要

Nectin蛋白是近年来新发现的一种细胞黏附分子，它在不需要Ca2+的情况下参与细胞间的黏连。Nectin蛋白家族共有四个成员：nectin-1、nectin-2、nectin-3和nectin-4，它们具有相似的结构特征：胞外段有三个连续的免疫球蛋白样结构域(immunologlobin-likedomain，Ig-likedomain)，分别是N端的一个Ig-Vdomian和C端的两个Ig-C2domain。Nectin蛋白通过顺式二聚化(cis-dimerization)和反式二聚化作用(trans-dimerization)来调节细胞间的黏连。作为nectin家族中的一员，nectin-2(CD112)除了拥有上面的结构特点和细胞黏附功能外，还有其它一些重要的生物学功能，如：作为某些病毒受体、介导病毒在细胞细胞间的传递和结合NK细胞和杀伤性T淋巴细胞(CTL)表面的活化性受体CD226从而激活NK细胞和CTL杀伤活性等等。 目前，有两个nectin样分子(Necl-1和Necl-5)的部分结构域的晶体结构得到解析，但是至今还未见有nectin蛋白结构报道。鉴于CD112在细胞黏附和肿瘤免疫方面具有重要功能，解析出CD112V结构域的晶体结构，将有助于深入理解其黏附机制，以及与病毒表位面蛋白及其受体CD226结合的精确位点，进而为预防病毒感染和肿瘤治疗提供结构学方面的理论依据。 为此，本文在原核细胞里表达nectin-2V结构域的包涵体(inclusionbodies)，经体外复性和纯化后得到可溶性蛋白，将其浓缩至浓度为5mg/ml和10mg/ml，使用悬滴气相扩散法生长晶体，并对晶体生长的条件进行优化。经X-射线衍射仪照射晶体后，收集到一套分辨率至1.85A的晶体衍射数据。随后的数据分析和处理显示晶体空间群为P21，晶胞参数为a=52.3A，b=43.9A，c=56.1A，andβ=118.2°，一个晶体学不对称单位中含有二个nectin-2V结构域分子。最终，我们解析得到了nectin-2Vdomain的晶体结构，它是由两个单体主要通过疏水作用形成一种反式的二聚体结构，且是第一个nectin蛋白结构。通过与其它两个Necl的V结构域结构比较发现，nectin-2多出一个很明显的loop。推测其可能是nectin-2与其受体CD226作用的关键位点，在后续实验中，我们计划利用tetramer技术构建相关蛋白四聚体，将其和表达在COS-7细胞表面的CD226结合，验证以上假设。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1细胞黏附分子

1.2免疫球蛋白超家族

1.3 nectin蛋白家族及其细胞黏附作用

1.4 nectin与Cadherin的关系

1.5 nectin蛋白在NK细胞免疫中的作用

1.6 nectin-2，CD155及其受体CD226

1.7MHC-Ⅰ四聚体技术

第2章引言

第3章材料和设备

3.1实验材料及设备

3.1.1细胞与细胞文库

3.1.2引物

3.1.3载体质粒

3.1.4仪器

3.1.5试剂及试剂盒

3.2溶液配制

第4章实验方法

4.1 CD112 V结构域的克隆构建、蛋白制备及晶体衍射

4.1.1 CD112 V-pET2la(+)表达质粒的构建

4.1.2 CD112 V结构域的小量表达分析

4.1.3 CD112 V结构域包涵体的大量制备

4.1.4 CD112 V结构域包涵体的复性

4.1.5 CD112 V结构域蛋白的纯化

4.1.6 CD112 V结构域蛋白的浓度测定

4.1.7 CD112 V结构域蛋白的结晶

4.2 CD112 V结构域硒代甲硫氨酸衍生物蛋白制备

4.3 CD112 V结构域及CD112 V结构域-?LOOP四聚体制备

4.3.1 CD112 V结构域四聚体制备

4.3.2 CD112 V结构域-?100p四聚体制备

4.4 COS7细胞培养及四聚体染色

4.4.1 COS7细胞复苏

4.4.2 COS7细胞传代

4.4.3 COS7细胞冻存方法

4.4.4 COS7细胞转染及检测

4.4.5 COS7细胞的四聚体(tetramer)染色

第5章结果与分析

5.1 CD112 V结构域蛋白的表达纯化

5.1.1 CD112 V-pET21a(+)表达质粒构建

5.1.2 CD112 V结构域的表达鉴定

5.1.3 CD112 V结构域的蛋白纯化

5.2 CD112 V结构域硒代甲硫氨酸衍生物蛋白纯化

5.3 CD112 V结构域的晶体衍射

5.3.1 CD112 V结构域及硒代甲硫氨酸衍生物的晶体生长

5.3.2 CD112 V结构域及硒代甲硫氨酸衍生物晶体的衍射数据收集及处理

5.4 CD112 V结构域晶体结构分析

5.4.1 CD112 V结构域晶体结构

5.4.2二聚体形成的作用力

5.4.3 CD112 V结构域与Necl(Necl-5和Necl-1)结构的比较

5.5 CD112分子与其受体CD226的相互作用研究

5.5.1 CD112 V结构域蛋白及CD112 V结构域蛋白的四聚体制备

5.5.2 COS7细胞染色及流式细胞术鉴定

5.6 CD112 V结构域三种蛋白的讨论

参考文献

附录

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