锁阳乙酸乙酯提取物含药血清对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的：采用血清药理学方法,以Aβ25-35制作大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）损伤模型,探讨锁阳乙酸乙酯提取物(The ethyl acetate extract of Cynomorium songaricum,ECS)含药血清对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用及作用机制。　　方法：1）制备ECS含药血清：Wistar大鼠48只，雌雄各半，随机分为4组，分别为空白组及ECS高中低三个剂量组，连续给药10天后，腹主动脉采血，制得空白组血清和ECS高中低剂量组含药血清；2）以不同浓度的Aβ25-35（5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/、80μmol/L）诱导PC12细胞24h、48h和72h，用MTT法检测细胞活力，确定其损伤PC12细胞建立AD早期病理损害的细胞模型的浓度和时间；3）分别加入5%、10%、20%浓度的空白血清和ECS高、中、低三个剂量的含药血清，孵育PC12细胞48h，MTT法检测细胞活力，探索含药血清作用于细胞的合适添加量；4）实验分为六组，分别为正常组（只含完全培养基）、模型组（完全培养基+Aβ25-35）、空白血清组（空白血清+完全培养基+Aβ25-35）、三个给药组（高、中、低三个剂量ECS含药血清+完全培养基+Aβ25-35），通过MTT法、LDH检测、Hoechst33342染色、流式细胞术检测分析ECS含药血清对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡情况的影响；5）实验分组如上，应用相应试剂盒检测细胞中MDA、NO含量及SOD、NOS活性；Western Blot检测各组细胞中Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表达情况。　　结果：1）40umol/L Aβ25-35诱导细胞48h后，MTT法测定模型组细胞存活率降低为（51.18±4.43）%，与正常组比较差异显著（P＜0.01），确定出40umol/L Aβ25-35诱导PC12细胞48h为最佳造模条件；2）在同一血清浓度下，各给药组与空白血清组相比，细胞存活率显著提高（P＜0.01），且有剂量依赖性；在同一组别培养基中，随着血清加入浓度的增大，细胞存活率也相应提高，但在10%浓度时细胞存活率提高最显著，又根据培养基中血清加入量的原则，故确定血清加入体积分数为10%作为ECS保护组的使用浓度；3）MTT、LDH检测结果：与正常组相比，模型组细胞存活率降低、LDH活性显著上升，具有统计学差异（P＜0.01），空白血清组与模型组相比无统计学差异(P＞0.05)，与模型组相比，高、中、低三个给药组的细胞存活率升高、LDH活性明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），其中高剂量组效果最佳；4）Hoechst33342染色显示：模型组和空白血清组凋亡核阳性细胞数目明显增高，细胞核体积增大，染色质浓集，荧光染色显示加深，应用ECS组细胞蓝色荧光强度明显减弱，核固缩、核碎裂细胞减少，状态与正常对照组细胞较相近；5）流式细胞仪检测显示：Aβ25-35诱导的PC12细胞经ECS作用后PC12细胞凋亡率下降，与模型组相比均具有显著性差异（P＜0.01）并且呈剂量依赖性；6）SOD、MDA、NOS、NO的测定结果显示：在Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞中，ECS可以显著升高SOD活性、降低受损细胞中MDA含量、降低NOS活性并减少NO的生成，与模型组比较有统计学意义（P＜0.05），且具有剂量依赖性；7）Western Blot结果显示：Aβ25-35作用PC12细胞后，Bax、Caspase-3蛋白表达量显著增加、Bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05），ECS各给药组能够显著升高Bcl-2蛋白表达水平、降低Bax及Caspase-3蛋白表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：1）40μmol/L Aβ25-35作用PC12细胞48h，为最佳损伤浓度和时间，可作为建立AD早期病理损害的细胞模型；2）在血清添加方法上，采用含药血清与常规培养血清并存的方法，添加量选用10%进行后续实验；3）MTT、LDH测定以及Hoechst染色和流式分析初步证实ECS含药血清对Aβ25-35致PC12细胞损伤具有保护作用，可显著提高受损细胞存活率，减轻细胞损伤；4）初探ECS发挥神经保护作用的潜在机制，一方面其通过升高SOD活性，降低MDA含量，降低NOS活性及NO含量，减轻Aβ导致的过度氧化应激以及NO介导的Aβ神经毒性对细胞的刺激损伤；另一方面通过上调抗凋亡Bcl-2蛋白的表达，下调促凋亡Bax蛋白的表达，并且抑制Caspase-3蛋白的表达，减少细胞的非正常性死亡，从而对神经细胞起到保护作用。

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凋亡