长叶红砂RtHKT1与RtKCO1钾离子转运蛋白基因的克隆及功能分析

摘要

长叶红砂(Reaumuria trigyna)是东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有的泌盐盐生植物，起源于第三纪，属古地中海孑遗成分，具有极强的耐盐抗旱性。转录组深度测序结果发现离子平衡调节在该植物盐胁迫响应过程中发挥了重要作用。高亲和性钾离子转运蛋白HKT与外向整流型钾离子通道蛋白KCO对于盐胁迫下植物的K+吸收、K+在不同组织间的分配运输以及维持Na+/K+平衡发挥着重要作用。本研究从长叶红砂中克隆RtHKT1及RtKCO1基因，对其表达特性进行研究，通过转酵母AXT3突变体验证其在不同离子胁迫下的功能，将为揭示RtHKT1及RtKCO1基因在调节植物适应盐生环境下的离子平衡机制奠定基础。主要结果如下:　　1.依据转录组测序基因序列信息扩增得到长叶红砂高亲和性钾离子转运蛋白基因，命名为RtHKT1，以及外向整流型钾离子通道蛋白基因，命名为RtKCO1。RtHKT1基因长为1941bp，包含1857bp的开放阅读框，编码619个氨基酸。RtKCO1基因长为1393bp，包含1076 bp的开放阅读框，编码358个氨基酸。亚细胞定位结果显示，RtHKT1与RtKCO1蛋白主要分布在细胞质膜上。　　2.基因表达特性分析结果显示，RtHKT1与RtKCO1在根、茎、叶中均有表达，且在叶中的表达量显著高于根、茎。在不同浓度NaCl胁迫下，与对照相比，两个基因表达量的总体变化趋势均为下调表达。随着胁迫浓度的增加，表达量变化均呈现出先降低后升高再降低的趋势，且均在200mM NaCl胁迫时表达量最高。在不同浓度KC1处理下，RtHKT1主要在0mM-10mM KC1处理下表达量显著增加， RtKCO1基因主要在25-50mM KCl处理下表达量显著增加，说明RtHKT1基因编码双亲和性K+转运蛋白，RtKCO1基因编码低亲和性K+通道。　　3.构建RtHKT1和RtKCO1基因的酵母表达载体，分别转入酵母突变体菌株AXT3中，转基因酵母在不同浓度Na+、K+等离子胁迫条件下，均能明显恢复生长，两个基因的表达均可显著提高酵母AXT3突变体对盐胁迫和K+胁迫的抵抗力。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 钾离子的生理作用及其转运

1．1．1 钾离子的生理作用

1．1．2 钾离子的转运

1．1．3 钾离子吸收转运系统

1．2 盐胁迫下植物的钠钾离子平衡机制

1．2．1 增加Na+外排

1．2．2 Na+区隔化

1．2．3 促进K+吸收

1．3 高亲和性钾离子转运蛋白HKT及外向整流型钾离子通道KCO研究进展

1．3．1 高亲和性钾离子转运蛋白HKT

1．3．2 外向整流型钾离子通道KCO

1．4 长叶红砂的研究进展

1．4．1 形态结构研究

1．4．2 生理生化与泌盐特性研究

1．4．3 长叶红砂的耐盐分子机制研究

1．5 研究意义及技术路线

1．5．1 研究意义

1．5．2 技术路线

第二章 长叶红砂高亲和性钾离子转运蛋白基因RtHKT1的克隆及功能分析

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 长叶红砂RtHKT1基因的克隆

2．2．2 长叶红砂RtHKT1基因的生物信息学分析

2．2．3 长叶红砂RtHKT1基因的表达特性分析

2．2．4 长叶红砂RtHKT1蛋白的亚细胞定位分析

2．2．5 长叶红砂RtHKT1基因的酵母真核表达与功能分析

2．3 结果与分析

2．3．1 RtHKT1基因的克隆及生物信息学分析

2．3．2 RtHKT1蛋白的氨基酸序列分析

2．3．3 RtHKT1基因的表达特性分析

2．3．4 RtHKT1蛋白的亚细胞定位分析

2．3．5 RtHKT1基因的酵母真核表达与功能分析

2．4 讨论

2．4．1 RtHKT1基因介导Na+、K+转运并增加转基因酵母耐盐性

2．4．2 RtHKT1基因介导Na+、K+转运的分子基础

第三章 长叶红砂外向整流型钾离子通道基因RtKCO1的克隆及功能分析

3．1 实验方法

3．1．1 长叶红砂RtKCO1基因的克隆

3．1．2 长叶红砂RtKCO1基因的生物信息学分析

3．1．3 长叶红砂RtKCO1基因的表达特性分析

3．1．4 长叶红砂RtKCO1蛋白的亚细胞定位分析

3．1．5 长叶红砂RtKCO1基因的酵母真核表达与功能分析

3．2 结果与分析

3．2．1 RtKCO1基因的克隆及生物信息学分析

3．2．2 RtKCO1蛋白的氨基酸序列分析

3．2．3 RtKCO1基因的表达特性分析

3．2．4 RtKCO1蛋白的亚细胞定位分析

3．2．5 RtKCO1基因的酵母真核表达与功能分析

3．3 讨论

3．3．1 RtKCO1基因为低亲和性钾离子通道并参与Na+的运输

第四章 结论

参考文献

攻读硕士期间发表学位论文

致谢