酿酒酵母蛋白Prp20p以及人源锌指蛋白DESR1的结构与功能研究

摘要

在此论文中我们分别用X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振波谱学(NMR spectroscopy)的方法解析了酿酒酵母蛋白Prp20p的β-propeller结构域(β-propeller domain)以及人源锌指蛋白DESR1的三维结构。
　　 本论文将分三个章节来阐述。
　　 第一章先介绍一下Prp20p所参与的核质输运这一重要的细胞生理过程的背景综述。在真核细胞中，核质的不同物质组成是由具有选择性和方向性的大分子的跨膜运输所维持的。核蛋白经由一类称为输入蛋白(importins)的核转运蛋白(karyopherins)运送至核内，而大半部分的RNA则通过输出蛋白(exportins)转运出核。这种运输的方向性是由RanGTP的梯度（核内是高浓度的RanGTP，而细胞溶质中则是低浓度的RanGTP）决定的。在胞质中缺乏RanGTP的情况下结合货物蛋白，然后在核质中随着RanGTP的结合而将货物蛋白释放。相反在核内，输出蛋白与RanGTP以及货物蛋白形成复合物，运送到胞质中之后随着GTP水解成GDP而解离。GTP的水解需要存在于细胞质中的RanGAP(RanGTPase-activating protein)。反过来，GTP到GDP的交换是由鸟苷交换因子(GEF，在哺乳动物中是RCCl，在酿酒酵母中是Prp20p)所催化，它存在于核内并与染色质相结合。
　　 第二章则将着重介绍Prp20p这一蛋白质的基本信息，然后是我们所用的实验方法以及随后所得到的实验结果。Prp20p是RCCl(Regulator of ChromosomeCondensation l)在酿酒酵母中的同源蛋白，它是小GTP酶Gsplp（Ran在酿酒酵母中的同源蛋白）的鸟苷交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)。Prp20p主要由类RCC1结构域（RCC l-1ike domain，RLD）和N端的核定位信号序列(nuclear localization signal)所组成。Prp20p的类RCC1结构域为典型的七叶螺旋桨结构(seven bladesβ-propeller)。在这个结构中，我们发现一个额外的β-wedge，而且随后我们也证明了这个区域参与了Prp20p和Gsplp的相互作用。然后我们构建了Prp20p-Gsplp的复合物模型，并用分子动力学模拟(moleculardynamics simulations)进行了优化。此外，我们还研究了Prp20p在体外条件下的组蛋白结合特性，意外地发现其更倾向于结合H3/H4，这与RCC1的组蛋白结合特性有显著的区别。
　　 第三章则介绍人源锌指蛋白DESR1的溶液结构研究。人源DESR1属于一个高度保守的CSL锌指蛋白家族（Pfam:PF05207）。DESR参与了翻译延伸因子2(translation elongation factor2,eEF-2)的翻译后修饰的第一步过程，使第715位的组蛋白（H715，在酵母中是H699）生成白喉酰胺(diphthamide)，这是ADP核糖基化(ribosylation)的靶位点。另外有实验证实了DESR1在鼠中对于胚胎和胎盘发育的重要性。我们用三维核磁共振波谱的方法解析了这个小蛋白的溶液结构。随后拿它跟其在鼠和酵母中的同源蛋白（mDESR1和KTI11）进行了结构比较，显示出结构的保守性以及些许的微小差异。最后讨论了这一类CSL锌指蛋白的分类问题。

目录

文摘

英文文摘

第一章 综述核质运输及其结构生物学

1.1 引言

1.2 KARYOPHERIN蛋白家族

1.3 入核转运（NUCLEAR IMPORT）

1.3.1 Importinβ介导的入核转运

1.3.2 Transportin介导的入核转运

1.4 出核转运（NUCLEAR EXPORT）

1.4.1 Csel介导的Importin α的出核转运

1.4.2 Crml介导的NES的出核转运

1.4.3 Xpot介导的tRNA的出核转运

1.5 Ran的循环

1.5.1 RanGAP催化GTP的水解

1.5.2 RCC1介导核苷酸交换

1.5.3 RanGDP的循环入核

1.6 核孔蛋白

参考文献

第二章 Prp20p的晶体结构及其与Gsplp和Histone的结合

2.1 Prp20p的背景功能介绍

2.1.1 RCCl/Prp20p的发现

2.1.2 RCCI/Prp20p的功能简介

2.1.3 RCCI超家族及其结构研究进展

2.2 实验材料和实验方法

2.2.1 文献调研

2.2.2 生物信息学调研

2.2.3 引物设计

2.2.4 PCR反应

2.2.5 PCR产物的回收

2.2.6 PCR产物和表达载体的双酶切

2.2.7 基因片段和载体的连接

2.2.8 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞以及鉴定和测序

2.2.9 初步的表达尝试

2.2.10 构建点突变体

2.2.11 制备实验用感受态细胞

2.2.12 蛋白质的诱导表达

2.2.13 蛋白质的Ni亲和柱纯化

2.2.14 利用分子筛进一步纯化蛋白

2.2.15 已纯化蛋白的甲基化(Reductive Methylation)

2.2.16 用于晶体筛选的蛋白样品准备

2.2.17 蛋白质结晶的初步筛选和优化

2.2.18 晶体晶胞衍射相位的获得

2.2.19 酵母组蛋白的表达及纯化

2.2.20 酵母组蛋白的三种多聚体的重构

2.2.21 GSTPull-down实验

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 Prp20p的克隆片段的选择

2.3.2 Prp20p以及Gsplp的表达与纯化

2.3.3 Prp20p的晶体筛选

2.3.4 晶体数据的收集以及结构解析和修正

2.3.5 Prp20p的晶体结构的描述

2.3.6 与RCCI超家族蛋白的结构比较(Structure comparison)

2.3.7 两个βwedge都参与了Prp20p与Gsplp的结合

2.3.8 Prp20p与Gsplp的复合物模型

2.3.9 Prp20p的组蛋白结合特性

2.4 本章小结

参考文献

第三章 人源的CSL锌指蛋白DESR1的溶液结构

3.1 DESR1的背景功能介绍

3.1.1 DESR1的发现及其基因和蛋白特点

3.1.2 DESR1参与白喉酰胺(Diphthamide)的生物合成

3.1.3 DESR1在鼠的胚胎发育中的作用

3.1.4 DESR1在分泌过程中的作用

3.1.5 酵母中的Ktill的功能和结构

3.2 实验材料和实验方法

3.2.1 DESR1的质粒的克隆

3.2.2 DESR1蛋白的表达与纯化

3.2.3 蛋白质的浓度测定

3.2.4 蛋白中锌的含量与配位

3.2.5 DESRI的同位素标记与NMR实验

3.2.6 数据处理与结构计算

3.3 实验结果和讨论

3.3.1 DESR1的表达纯化

3.3.2 DESR1中的锌含量测定

3.3.3 DESR1的EXAFS分析

3.3.4 DESR1的NMR实验和结构计算

3.3.5 DESR1的结构描述与分析

3.3.6 结构比较

3.4 本章小结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果