大鼠矽肺差异蛋白的筛选及S100A8在矽肺纤维化中作用的实验研究

摘要

目的：本研究通过制备不同时期的矽肺大鼠模型，利用蛋白质组学中的双向凝胶电泳和质谱分析技术，探讨在不同时期矽肺大鼠肺组织中均呈明显差异表达的蛋白种类，并挑选其中评分最高的一种蛋白（S100A8）在矽肺动物模型和细胞水平加以验证，了解 S100A8与矽肺的相关性，为矽肺的发病机制的进一步研究提供实验依据。　　方法：1、大鼠矽肺模型的复制：SPF级雄性 Wistar大鼠90只适应性饲养一周，随机分为2组，模型组（即染矽尘组）60只、空白对照组30只。模型组利用非暴露气管法一次性灌注 SiO2悬液复制矽肺模型，空白对照组以灭菌生理盐水替代。建模时间记为0周，于染尘后1周、2周、3周、4周、6周和8周6个时间点处死模型组10只和空白对照组5只大鼠，同时肉眼观察大鼠肺脏病理变化，迅速取出肺组织，大部分保存在液氮中备用，并将余下肺组织甲醛固定以鉴定造模是否成功及免疫组化检查；2、矽肺差异蛋白的筛选：利用双向电泳技术筛选矽肺的差异蛋白点，对所筛选的部分差异蛋白进行质谱分析；挑选其中评分最高的差异蛋白S100A8进行验证；3、矽肺差异蛋白的验证：①制作大鼠模型组和空白对照组肺组织的石蜡切片，免疫组织化学检测 S100A；②提取大鼠模型组和空白对照组的肺组织总蛋白及RNA；③再选SPF级雄性Wistar大鼠建立矽肺模型，支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞，用 SiO2进行刺激，18小时后收集上清液并保存；④体外肺纤维化模型的复制：胰酶消化法获取肺成纤维细胞，培养至第4代，用收集的SiO2刺激的巨噬细胞上清进行刺激；⑤制作细胞爬片，免疫细胞化学检测S100A8；⑥提取体外纤维化模型和空白空白对照组细胞的总蛋白及 RNA；⑦Western-blot法和实时定量荧光PCR检测S100A8在大鼠矽肺模型和细胞水平不同时间点的表达情况，应用自动图像分析系统对结果进行图像分析；4、应用 SPSS16.0统计软件，对实验数据采用单因素方差分析比较多组间均数进行统计学分析。　　结果：1、成功复制了大鼠矽肺模型；2、双向电泳技术筛选出45个矽肺差异蛋白点，选取其中7个点质谱分析结果得到6个差异蛋白；3、免疫组织化学和免疫细胞化学检查：空白对照组 S100A8呈微弱表达，模型组 S100A8表达高于空白对照组，随时间点增加而逐渐增强；4、Western-blot法检测结果显示S100A8在空白对照组呈弱表达，在大鼠矽肺模型和细胞水平中的表达均高于空白对照组且呈逐渐升高，且组间差异有统计学意义（P<0.05）；5、实时定量荧光 PCR检测结果显示S100A8在空白对照组呈弱表达，在大鼠矽肺模型和细胞水平中的表达均高于空白对照组且呈增高趋势，组间差异有统计学意义（P<0.05）。　　结论：1、过氧化物还原酶、α-烯醇化酶、巨噬细胞加帽蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙结合蛋白 A8及肌动蛋白在矽肺发展过程的不同时期均呈差异性表达；2、经矽肺动物模型和细胞水平的验证，钙结合蛋白 S100A8在矽肺纤维化的发展中呈高表达，可能在矽肺的发展中发挥重要作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略表

引言

第1章 实验研究

1.1 材料与方法

1.1.1 实验动物及模型试剂

1.1.2 实验主要仪器设备

1.1.3 实验主要试剂

1.1.4 实验部分试剂的配制

1.1.5 实验分组及矽肺模型的复制

1.1.6 大鼠矽肺组织差异蛋白的筛选

1.1.7 差异蛋白S100A8的验证

1.1.8统计方法

1.2 结果

1.2.1大鼠矽肺组织差异蛋白的筛选

1.2.2 差异蛋白S100A8的验证

1.3 讨论

1.4 小结

参考文献

第2章 综 述:钙结合蛋白S100A8在矽肺纤维化中的研究

2.1 S100蛋白的概述

2.2 S100A8结构特点

2.3 S100A8在肺部疾病中的研究

2.3. 1 炎症

2.3. 2 癌症

2.3. 3 矽肺

2.4 S100A8在其他器官疾病的研究

2.5 小结

参考文献

结论

致谢

导师简介

作者简介

学位论文数据集