19F定点标记及19F核磁共振方法在蛋白质结构和动力学研究中的应用

摘要

在此论文中我们主要讨论了应用非天然氨基酸标记和19F核磁共振相结合的方法研究蛋白质的结构和动力学,论文共分为六个章节。
　　 第一章简要概述了蛋白质结构、功能和动力学之间的关系,以及用于研究蛋白质结构、功能和动力学的核磁共振方法。蛋白质功能的多样性与其空间结构密不可分,蛋白质的空间结构是蛋白质的功能活性基础。蛋白质结构是内部动态的过程,动力学特性对蛋白质的功能发挥具有重要作用。NMR方法可以在很宽的时间尺度上进行蛋白质动力学的研究。针对大分子量蛋白和信号灵敏度较低的情况下,可以采用固体核磁共振和位点特异性氨基酸标记的方法进行蛋白质结构、功能和动力学的研究。
　　 第二章介绍了用非天然氨基酸位点特异性标记的方法研究蛋白质的结构和动力学。核磁共振能够研究适当大小蛋白质的结构、配体结合、构象变化等,研究更大的蛋白质需要发展硬件以及同位素标记方法等。由于大分子量蛋白质的氨基酸数目较多,弛豫较快,线宽很宽,信号较弱,往往导致重叠的核磁谱峰难以进行归属。单氨基酸特异性标记可以减少核磁谱峰的重叠,但是对于含有很多同种氨基酸的大蛋白还是解决不了问题。但是位点特异性非天然氨基酸标记只有一个核磁信号出现,使得核磁信号的归属非常容易。本章介绍了目前用于核磁共振研究的非天然氨基酸的种类和标记方法,分别介绍了液体和固体核磁在非天然氨基酸标记研究中的应用。
　　 第三章描述了应用19F位点特异性氨基酸标记的方法对蛋白质的动力学分析。我们成功的化学合成了主链和侧链双标记非天然氨基酸15N／l9FtfmF,用一对正交的氨酰tRNA合成酶/tRNACUA实现了将双标记非天然氨基酸插入到水溶性蛋白和膜蛋白的特异性位点。对人源Vinexin蛋白C末端第一个SH3domain进行了配体结合前后的动力学分析。将15N/19FtfmF标记在SH3结构域的三个不同位点,得到了三个不同位点的主链和侧链化学位移。对SH3在配体P868结合前后的主链(15N)1H、侧链19F的化学位移和弛豫分析表明,三个不同位点在配基结合前后具有不同的内部运动。接着我们用SH3结构域在60％甘油中的样品模拟了大分子量蛋白的运动,对其一维19F谱和侧链T1、T2进行了分析。另外,我们对膜蛋白DGAK三聚体在DPCmicell中的化学位移和侧链弛豫分析表明,这种非天然氨基酸位点特异性标记的方法可以用于分析膜蛋白的侧链内部运动。
　　 第四章阐述了19F位点特异性氨基酸标记方法的其他应用。首先以膜蛋白DAGK为例,分析了19F位点特异性氨基酸标记在膜蛋白溶剂暴露中的研究,结果表明位于DAGK不同位置的氨基酸残基化学位移的变化是不同的,与已知三维结构中残基的位置分布一致。其次,应用位点特异性19F弛豫增强实验(PRE)对一个多结构域蛋白L27tan的两种结构构象进行了辨认。通过检测半胱氨酸上的自旋标记物MTSL和位点特异性标记的氨基酸tfmF之间的PRE效应,判断两个位点在空间结构上的距离。结果表明,L27tan在溶液中采取关闭型的构象。最后是对19F位点特异性标记膜蛋白DAGK的原位固体核磁共振研究。用原位MAS固体核磁共振的方法对DAGK在天然膜环境中的化学位移和侧链弛豫进行了分析。与DAGK/DPC样品的液体核磁数据比较表明,位于膜蛋白不同位置的氨基酸残基的化学位移和纵向弛豫受膜环境的影响不同。
　　 第五章主要概括了对BK钾离子通道跨膜螺旋S0和S1之间loop(S0-S1loop)的液体核磁共振研究。BK钾离子通道是一种大电导钾离子通道,能够被Ca2+、Mg2+和电压所激活,在许多生理过程中发挥重要作用。与其他电压门控钾离子通道不同的是,BK钾离子通道具有7个跨膜螺旋和S0-S1loop,我们用液体核磁共振的方法对S0-S1loop的二级结构和主链动力学进行了分析。Xplor-NIH结构计算表明S0-S1loop中有两个双亲的α螺旋,可能与细胞膜或者跨膜螺旋有相互作用。Mg2+滴定实验结果表明,单独的S0-S1loop存在时T45和L46有化学位移扰动而Mg2+结合位点D99却没有化学位移变化。
　　 第六章主要展望了如何利用19F非天然氨基酸标记的方法将蛋白质的结构和动力学偶联起来。细胞膜中的膜蛋白结构代表了其真实的结构,蛋白质的结构和功能不仅取决于蛋白质本身,其周围的膜环境对其结构和功能的发挥具有重要作用,包括蛋白-蛋白相互作用,蛋白-磷脂相互作用等。因此,简略探讨了在Insitu情况下,如何解析膜蛋白的结构。