HIF-1α信号通路在慢性肾脏病血管钙化中的表达及作用研究

摘要

目的：血管钙化(vascular calcification,VC)是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的常见并发症，在CKD各个阶段均可发生，严重影响CKD患者的生命健康，然而其发生发展的具体机制仍未完全阐明，临床防治措施有限。因此本研究通过腺嘌呤灌胃联合高磷饲料喂养诱导CKD血管钙化大鼠模型，观察大鼠主动脉低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factors1alpha,HIF-1α)、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)及Notch1的表达，探讨HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路在CKD血管钙化中的作用，为探索CKD血管钙化的具体机制及临床防治措施提供新策略。　　方法：将60只SD大鼠随机分为对照组(CON组，15只)、腺嘌呤灌胃组(CKD组，20只)、腺嘌呤灌胃联合高磷饲料喂养组(CKD+HP组，25只)。CON组及CKD组予以普通大鼠饲料喂养，CKD+HP组予以1.2%高磷饲料喂养；CKD组及CKD+HP组将2.5%腺嘌呤混悬液以250mg/(kg·d)的剂量第1-4周每日灌胃1次，第5-8周隔日灌胃1次，CON组予以10ml/kg生理盐水灌胃。在建模后第4、6与8周末，分别从各个组中随机选取5只大鼠收集标本：收集24h尿液检测尿蛋白定量；腹主动脉采血检测尿素(Urea)、肌酐(Scr)、胱抑素(Cys C)、血钙(Ca2+)和血磷(P3-)；酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清HIF-1α水平；测量肾重/体重指数；苏木精-伊红(HE)染色法观察肾脏及血管病理改变；全组织Von kossa染色、茜素红染色与主动脉钙含量测定评估血管钙化情况；免疫组化检测大鼠主动脉α-SMA、Runx2、HIF-1α、VEGFA及Notch1蛋白表达；Real-time PCR检测大鼠主动脉组织α-SMA、Runx2、HIF-1α、VEGFA和Notch1mRNA表达。　　结果：1、大鼠体重、肾重及肾重/体重指数：与CON组相比，CKD及CKD+HP组大鼠体重各时间点均明显降低(P＜0.001)，肾重及肾重/体重指数均明显升高(P＜0.001)；与CKD组相比，CKD+HP组大鼠体重在第4周和第8周末更低(P＜0.01;P＜0.05)，肾重在第6周末更高(P＜0.001)，肾重/体重指数在第4周与第6周末更高(P＜0.05;P＜0.001)。2、血清学指标：(1)Urea、Scr与Cys C：与CON组相比，CKD及CKD+HP组大鼠各时间点Urea、Scr与Cys C明显增加(P＜0.01)；与CKD组相比，CKD+HP组大鼠各时间点Scr更高(P＜0.05)，各时间点Urea及Cys C无明显差异。(2)Ca2+、P3-与Ca2+×P3-：与CON组相比，CKD+HP组大鼠第4周及第8周血Ca2+降低(P＜0.05)，CKD组及CKD+HP组大鼠各时间点血P3-及Ca2+×P3-明显升高(P＜0.01;P＜0.05)；与CKD组相比，CKD+HP组大鼠第6周和第8周末血P3-及Ca2+×P3-更高(P＜0.01,P＜0.05)。3、24h尿蛋白定量：CKD及CKD+HP组大鼠各时间点24h尿蛋白定量较CON组明显增加(P＜0.01)，而CKD组与CKD+HP组无明显差异；CKD及CKD+HP组24h尿蛋白定量随时间进展逐渐增多(P=0.009,P=0.003)。4、血清HIF-1α水平：CKD及CKD+HP组血清HIF-1α水平随时间进展逐渐增多(P=0.009,P=0.033)，在第8周末其水平较CON组明显升高(P＜0.05)，而两组在各个时间点无明显差异。5、肾脏病理改变：(1)肉眼：CON组：双侧肾脏大小正常，色暗红，表面光滑，质软，弹性好，切面皮髓质分界清晰；CKD与CKD+HP组：双侧肾脏体积增大，色灰白，呈“大白肾”改变，表面不光滑，质硬，弹性差。(2)HE染色：CON组肾小球、肾小管及肾间质结构及形态均正常；CKD及CKD+HP组自第4周末部分肾小球可见萎缩、囊腔轻度扩张，肾小管扩张、较多棕黄色物质沉积，肾间质纤维化，后随时间进展病变逐渐加重，且CKD+HP组肾间质纤维化较CKD组出现早、程度重。6、主动脉病理改变：(1)肉眼：CON组各时间点大鼠主动脉形态正常，弹性好；CKD组第4周末大鼠形态尚光滑，弹性稍差，自第6周末大鼠主动脉逐渐出现弯曲、膨大，钙化结节，弹性差，血管脆性增加；CKD+HP组第4周末大鼠主动脉即弯曲、膨大明显，表面不光滑，出现钙化结节，弹性极差，易脆，且随时间进展钙化结节逐渐增多。(2)HE染色：CON组各时间点大鼠主动脉形态结构正常；CKD组第4周末大鼠主动脉中膜弹性纤维排列紊乱，第6周末主动脉中膜呈节段性断裂，弹性纤维减少，第8周末中膜呈连续线性断裂，弹性纤维更少；CKD+HP组自第4周末大鼠主动脉即可见管壁增粗，中膜呈连续线性断裂，弹性纤维明显减少，并随时间进展逐渐加重。7、主动脉钙化情况：(1)全段血管Von kossa染色：CON组大鼠主动脉无黑色物质沉积；CKD组大鼠主动脉第6周末可见节段性黑色物质沉积，第8周末黑色物质沉积明显增加；CKD+HP组第6周及第8周大鼠主动脉全段血管均可见黑色物质弥漫性沉积。(2)茜素红染色：CON组各时间点大鼠主动脉未见橘红色物质沉积；CKD组大鼠主动脉自第6周末可见节段性橘红色物质沉积，第8周末橘红色物质沉积明显增加；CKD+HP组大鼠主动脉自第4周末可见橘红色物质呈连续线状沉积于主动脉中膜，并随时间进展，橘红色物质沉积逐渐增多。(3)大鼠主动脉钙含量：CKD+HP组各时间点主动脉钙含量均较CON及CKD组明显增加(P＜0.001,P＜0.05)，CKD组第6周与第8周主动脉钙含量较CON组明显增加(P＜0.001)，且CKD+HP及CKD组主动脉钙含量随时间进展逐渐增加(P=0.002,P＜0.001)。8、主动脉蛋白表达：(1)α-SMA蛋白表达：与CON组相比，CKD组大鼠在第6周与第8周末及CKD+HP组大鼠各时间点主动脉α-SMA蛋白表达明显降低(P＜0.01)，且CKD组α-SMA的表达随时间进展逐渐降低(P=0.001)；与CKD组相比，CKD+HP组大鼠在第4周及第6周主动脉α-SMA蛋白表达更低(P＜0.05)。(2)Runx2蛋白表达：CKD+HP组大鼠各时间点主动脉Runx2蛋白表达较CON及CKD组均明显升高(P＜0.001,P＜0.01)，CKD组大鼠在第6周和第8周末主动脉Runx2蛋白表达较CON组明显升高(P＜0.01)，且CKD及CKD+HP组Runx2蛋白表达随时间进展逐渐增加(P＜0.001,P=0.017)。(3)HIF-1α蛋白表达：CKD+HP组大鼠各时间点主动脉HIF-1α蛋白表达较CON及CKD组均明显升高(P＜0.001,P＜0.05)；CKD组大鼠在第6周与第8周末主动脉HIF-1α蛋白表达较CON组明显升高(P＜0.01)，且CKD组HIF-1α的表达随着时间进展逐渐增加(P＜0.001)。(4)VEGFA蛋白表达：与CON组相比，CKD组大鼠第6周与8周时、CKD+HP组大鼠各时间点主动脉VEGFA蛋白表达均明显增加(P＜0.05,P＜0.001)；与CKD组相比，CKD+HP组大鼠第4周与8周末主动脉VEGFA蛋白表达更高(P＜0.05)；CKD及CKD+HP组VEGFA的表达均随时间进展逐渐增加(P=0.001,P=0.007)。(5)Notch1蛋白表达：与CON组相比，CKD组大鼠在第8周末、CKD+HP组大鼠各时间点主动脉Notch1蛋白表达明显增加(P＜0.01,P＜0.001)，且CKD组Notch1的表达随时间进展而增加(P=0.001)；与CKD组相比，CKD+HP组大鼠在第4周与6周末主动脉Notch1蛋白表达更高(P＜0.05)。　　结论：1、腺嘌呤灌胃联合高磷饲料喂养大鼠，较单独腺嘌呤灌胃能够更加快速、稳定地建立慢性肾脏病血管钙化动物模型；2、高磷血症促进慢性肾脏病血管钙化及肾脏病进展；3、慢性肾脏病大鼠主动脉钙化时存在HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路激活，表明HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路可能参与了CKD血管钙化的发生发展；4、慢性肾脏病血管钙化大鼠血清HIF-1α水平明显升高，且与主动脉钙化严重程度成显著正相关，有望成为评估CKD血管钙化严重程度的血清学标志物之一。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物

1.2 主要实验试剂

1.3主要实验仪器

1.4主要溶液配制

2 实验方法

2.1 建立模型

2.2 动物取材及标本采集

2.3 指标检测

结果

1 模型建立

1.1 各组大鼠一般情况

1.2 各组大鼠死亡情况

1.3 各组大鼠体重、肾重、肾重/体重指数

1.4 各组大鼠血清学检测结果

1.5 各组大鼠尿液检测结果

2 大鼠血清HIF-1α水平

3.1肉眼改变

3.2显微镜下病理改变

4 大鼠主动脉病理改变

4.1肉眼病理改变

4.2显微镜下病理改变

5 大鼠主动脉钙化情况检测

5.1大鼠主动脉全组织Von kossa染色结果

5.2大鼠主动脉茜素红染色结果

5.3大鼠主动脉钙含量检测

6 免疫组化法检测大鼠主动脉蛋白的表达

6.1大鼠主动脉α-SMA、Runx2蛋白表达

6.2大鼠主动脉HIF-1α、VEGFA与Notch1蛋白的表达

7 RT-PCR法检测大鼠主动脉mRNA的含量

7.1大鼠主动脉α-SMA与RUNX2 mRNA的表达

7.2大鼠主动脉HIF-1α、VEGFA与Notch1 mRNA的表达

8 相关性分析

8.1主动脉钙含量与血清钙、磷及钙磷乘积

8.2血清磷与血清Urea、Scr及Cys C

8.3主动脉钙含量与血清HIF-1α及主动脉HIF-1α、VEGFA、Notch1蛋白

8.4主动脉HIF-1α、VEGFA与Notch1蛋白表达的相关性分析

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

研究生期间发表论文

致谢

综述:HIF-1α与血管钙化研究进展

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