miR-455-3p通过靶向PAX6调控胶质瘤细胞增殖

摘要

目的：胶质瘤是一种缺乏有效治疗方法，且进展快、生存率很低的严重威胁人类健康的肿瘤。胶质瘤的发展总是与参与细胞周期的调节因子的表达水平的变化有关。近年来越来越多的报道显示，miRNA的异常表达与肿瘤进展有关，并且miRNA的上调或下调与多种肿瘤中的致癌或抑制作用密切相关，例如肺癌，乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌甚至胶质母细胞瘤等。本实验的研究目的在于：1.检测miR-455-3p在胶质瘤中的表达情况；2.找到miR-455-3p在胶质瘤发生发展过程中所起到的作用；3.探讨miR-455-3p在胶质瘤发生发展中的作用机制。　　方法：1.收集39位胶质瘤患者的组织标本（均未在术前接受放化疗治疗），根据病理及临床分期进行分组。采用实时定量聚合酶链反应法（qRT-PCR）测定胶质瘤组织中miR-455-3p的含量；2.购买多株胶质瘤细胞株(SW1783,A172,U87,U251和H4)和一株正常人星形胶质细胞(NHA)，利用qRT-PCR检测胶质瘤细胞株和正常人星形胶质中miR-455-3p的表达情况；3.通过转染过表达或者抑制miR-455-3p的表达，利用qRT-PCR检测转染效率；4.利用MTT检测过表达或者抑制miR-455-3p的表达后，胶质瘤细胞增殖能力的变化情况；5.采用生物信息学分析，预测miR-455-3p的靶基因，并用免疫印迹法和荧光素酶报告基因实验证明PAX6为miR-455-3p的靶基因；6.通过功能回复实验，验证miR-455-3p是通过PAX6在胶质瘤中发挥作用；7.采用qRT-PCR和Western blotting法检测miR-455-3p和PAX6异常表达情况下，细胞周期调节因子的表达情况。　　结果：1.在胶质瘤组织中，miR-455-3p的表达水平在临床分级为IV级的患者中比II级的患者更高（P<0.05）；2.在胶质瘤细胞株中，miR-455-3p的表达水平明显高于正常星形胶质细胞（P<0.05）；3.在细胞中miR-455-3p的过表达增加了胶质瘤细胞的增殖，干扰了细胞周期的进程（P<0.01）。值得注意的是，内源性miR-455-3p沉默通过调节细胞周期进程显著地阻止了胶质瘤细胞的增殖（P<0.05）。4.生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验的结果表明，PAX6是miR-455-3p的靶基因；5.PAX6调控细胞周期，PAX6沉默选择性调控p21表达（P<0.01）。同时，在胶质瘤细胞中重新引入PAX6表达载体，挽救了miR-455-3p过度表达所产生的肿瘤促进效应；6.miR-455-3p是通过PAX6调控p53的表达，来调节胶质瘤的细胞周期通路，进而影响胶质瘤细胞的增殖。　　结论：1．miR-455-3p在胶质瘤组织和细胞中均呈高表达；2．miR-455-3p可以促进胶质瘤的细胞增殖；3．PAX6是miR-455-3p的靶基因；4．MiR-455-3p通过PAX6选择性调节胶质瘤的细胞周期通路。这些结果首次表明，miR-455-3p的高表达，通过靶向PAX6，在胶质瘤中发生发展中起着重要作用。此外，这些结果表明，通过转录水平调节细胞周期元素，miR-455-3p有可能成为一种针对胶质瘤的治疗方法。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 临床标本

1.2 实验细胞

1.3 质粒和siRNA

2.1 主要试剂

2.2 主要抗体

2.3 主要试剂的配制

3 主要实验仪器

4 实验方法

4.1 实时定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

4.4 细胞转染

4.5 MTT法检测细胞增殖

4.6 细胞周期分析

4.7 统计学分析

结果

1 MiR-455-3p在胶质瘤中表达上调

2 MiR-455-3p促进胶质瘤细胞增殖

3 PAX6是miR-455-3p的靶基因

4 MiR-455-3p通过PAX6选择性调节胶质瘤的细胞周期通路

5 PAX6的上调逆转了miR-455-3p对胶质瘤的过度表达

讨论

1 胶质瘤的研究现状

2 miRNA的研究进展

3 miRNA与胶质瘤

4 miR-455-3p的研究进展

5 PAX6的研究进展

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:miRNA在胶质瘤中的研究进展

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