激活TGR5受体对内皮素-1诱导乳鼠心肌细胞肥大的作用及机制

摘要

目的：心肌肥厚是心脏对各种刺激产生的适应性增生，是一种产生缓慢而有效的代偿功能，但这种代偿功能可增加心肌的耗氧量，逐渐导致心力衰竭，使心血管意外风险增加，甚至发生猝死，探索预防、减轻甚至逆转心肌肥厚的方法意义重大。心肌肥厚的刺激因素包括机械牵张、压力负荷、缺血、缺氧、一氧化氮缺乏及各种炎症因子，其中内皮素-1（ET-1）是诱导心肌肥厚的原因之一。G蛋白结合胆汁酸受体1（TGR5）是一种由胆汁酸（BA）调控的细胞表面G蛋白偶联受体，又称为GPBAR1、M-Bar、CPR131或BG37，是GPCR家族中的一员，广泛表达于肝脏、小肠、心脏、骨骼肌、脾脏、肾脏、胎盘和白细胞等组织器官中，参与体内胆汁酸、糖代谢、脂代谢及能量代谢等病理生理过程。本课题以乳小鼠心肌细胞为研究对象，观察激动心肌细胞细胞膜上的TGR5受体对ET-1诱导的心肌细胞肥大的影响，并探索其可能的机制，为改善心肌肥厚提供治疗思路。　　方法：原代培养乳鼠心肌细胞。1、观察不同浓度ET-1培养不同时间对心肌细胞的影响。实验分组：空白对照组、ET-110-8mmol/L组、ET-110-7mmol/L组、ET-110-6mmol/L组，各组分别干预12h、24h、36h、48h；分别检测各组心肌细胞表面积和总蛋白浓度，建立心肌肥大细胞模型。2、siRNA-TGR5转染心肌细胞。分为对照组、siRNA-NC、siRNA1-TGR5、siRNA2-TGR5和siRNA3-TGR5，转染6小时后采用Western blot和RT-PCR检测TGR5受体蛋白和TGR5mRNA表达水平，选择效果明显的siRNA-TGR5进行后续实验。3、观察TGR5激活对心肌细胞肥厚的影响并探讨其机制。实验分组：空白对照组：给予DMEM/F-12完全培养液培养48h；ET-1组：给予ET-110-6mmol/L培养48h；ET-1+INT-777组：给予ET-110-6mmol/L和TGR5受体特异性激动剂INT-77730umol/L(根据本实验组得出的数据，论文暂未公布)共同培养48小时；ET-1+INT-777+TGR5siRNA1组：先予以TGR5siRNA1转染心肌细胞6小时后，给予ET-110-6mmol/L和INT-77730umol/L共同培养48小时；ET-1+INT-777+TGR5siRNA-NC组：先予以TGR5siRNA空病毒转染心肌细胞6小时后，给予ET-110-6mmol/L和INT-77730umol/L共同培养48小时。采用图像分析系统测定心肌细胞表面积，BCA法测定细胞总蛋白量，RT-PCR检测TGR5、钙调神经磷酸酶（CaN）的mRNA，Western blot方法检测心房尿钠因子（ANF）、β-肌球蛋白重链（β-MHC）、TGR5、CaN、活化T细胞核因子3（NFAT3）的蛋白表达变化。　　结果：1、ET-1诱导心肌细胞肥大在10-8mmol/L～10-6mmol/L浓度范围内成明显浓度依赖性，在48小时内培养的时间越长，心肌细胞肥大越明显。选择浓度为10-6mmol/L ET-1培养48h建立心肌肥大的细胞模型。2、siRNA-TGR5转染心肌细胞的验证实验中，siRNA1-TGR5组TGR5mRNA明显减少，TGR5受体蛋白表达明显减少，siRNA-TGR5转染心肌细胞成功。选择siRNA1-TGR5进行后续实验。3、与对照组相比，ET-1组的心肌细胞表面积、总蛋白及促肥大因子表达增加，CaN及NFAT3的表达也增加。与ET-1组相比，ET-1+INT-777组的心肌细胞表面积、总蛋白及促肥大因子表达增加受到抑制，CaN及NFAT3的表达增加受抑制。与ET-1+INT-777组相比，ET-1+INT-777+TGR5siRNA1组的心肌细胞表面积、总蛋白及促肥大因子表达增加，CaN及NFAT3的表达也增加；与ET-1组相比无统计学差异。与ET-1+INT-777+TGR5siRNA1组相比，ET-1+INT-777+TGR5siRNA-NC组心肌细胞表面积、总蛋白及促肥大因子表达增加受到抑制，CaN及NFAT3的表达增加受抑制；与ET-1+INT-777组相比无统计学差异。　　结论：在48h内，ET-1诱导心肌细胞肥大在10-8mmol/L～10-6mmol/L浓度范围内成浓度依赖性和时间依赖性；激活心肌细胞膜上TGR5受体后可抑制ET-1诱导的小鼠心肌细胞肥大，其机制可能与抑制CaN-NFAT3信号通路有关。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1 实验动物

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

5 统计学方法

结果

1 ET-1诱导乳鼠心肌细胞表面积增大，总蛋白增加

2 TGR5-siRNA转染后乳鼠心肌心肌细胞TGR5mRNA及蛋白表达

3 TGR5激活后抑制ET-1诱导乳鼠心肌细胞表面积的增大和总蛋白量的增加

4 TGR5激活后对ET-1诱导乳鼠心肌细胞ANF及β-MHC蛋白表达的影响

5 TGR5激活后对ET-1诱导心肌细胞CaNmRNA及蛋白的表达的影响

6 TGR5激活后对ET-1诱导心肌细胞NFAT3核蛋白的表达的影响

讨论

结论

参考文献

英文缩略语

致谢

综述:TGR5与心血管病

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