肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸和肠黏膜损伤标记物在HIV感染组和健康组的对比研究

摘要

目的：艾滋病是一种常见的性传播疾病，当HIV病毒感染后会引起严重的细胞免疫缺陷并导致各种机会性感染，严重危害人类健康。临床上绝大多数发展至AIDS期的患者会出现慢性腹泻、腹痛等消化道症状，研究证明可能与肠道黏膜损伤、肠道菌群易位、肠道微生态失衡等病理机制有关，但具体机制尚不明确。正常状况下，机体与微生物群间存在互利共惠的共生关系，肠道微生物群及代谢产物在促进营养物质消化吸收、维持肠道正常生理功能，调节机体免疫等众多生命活动起重要作用。本实验的研究对象将选择尚未发展至AIDS期的HIV感染者，观察其肠道微生态及肠道黏膜损伤情况，以及探究其肠道微生态与肠黏膜损伤、细胞免疫状态是否具有相关性。本实验将从以下几个方面进行研究：1.对比HIV感染者和健康人群肠道菌群分布及其重要代谢产物短链脂肪酸的差异；2.对比HIV感染者与健康人群肠粘膜损伤标记物的差异；3.分析肠道菌群分布及不同短链脂肪酸与肠粘膜损伤标记物有无相关性；4.分析肠道菌群分布及不同短链脂肪酸与HIV感染者的CD4+、CD8+T细胞数和CD4/CD8比值有无相关性；从而为进一步完善HIV感染引起肠道损伤的机制以及肠道微生态相关的治疗方法用于艾滋病的预防和治疗打下理论基础。　　方法：收集来自于传染病医院的符合入选标准的HIV感染者15例以及符合入选标准的健康者10例，所有入选对象均在实验前签订知情同意书，并获四川省人民医院伦理道德委员会批准。采集两组人群粪便标本后-80℃低温保存，用高通量测序法检测两组人群肠道菌群的分布情况及其差异；用气相色谱-质谱法（GC-MS）联合分析两组人群粪便中各短链脂肪酸的含量；采集血液标本，离心后用酶联免疫吸附法（ELISA）测定两组人群血清中能够反映肠粘膜损伤情况的循环标记肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）和D-乳酸的含量；用流式细胞术（FUM）检测反映HIV感染者细胞免疫状态的CD4+、CD8+T细胞数和CD4/CD8比值。最后使用SPSS19.0统计软件，采用Mann-Whitney检验，t检验进行分析细菌种属或者OTUs组间统计学差异分析，采用Person法进行相关性分析，P＜0.05提示差异有统计学差义。　　结果：　　1.肠道菌群分布：和健康对照组相比，在门水平上，HIV感染组肠道的拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭菌门、放线菌门不存在显著差异；在纲水平上，只有Negativicutes菌显著增多；在科水平上，理研菌Rikenellaceae和分支杆菌Microbacteriaceae菌显著减少，莫拉菌Moraxellaceae显著增多；在属水平上，罗氏菌 Roseburia、毛螺旋菌Lachnospiraceae、Alistipes菌、瘤胃球菌Ruminococcaceae明显减少；嗜冷杆菌Psychrobacter明显增多。　　2.各短链脂肪酸定量：和健康对照组相比，HIV感染组肠道丁酸和戊酸含量明显减少，其他短链脂肪酸含量不存在差异。　　3.血清肠道黏膜损伤标记物：HIV感染组和健康对照组相比，血清肠道黏膜损伤标记物I-FABP和D-乳酸值不存在差异。　　4.细胞免疫：HIV感染者的CD4+T细胞数目＞200/μL，CD8+T细胞升高，CD4/CD8比值下降，符合尚未发展至AIDS期HIV感染者的细胞免疫状态。　　5.肠道菌群分布与丁酸和戊酸的相关性分析：在科水平上，HIV感染者肠道丁酸含量的降低主要与理研菌科Rikenellaceae、瘤胃球菌科Ruminococcaceae呈正相关。戊酸含量降低主要与理研菌科Rikenellaceae、消化球菌科 Peptococcaceae、瘤胃球菌科Ruminococcaceae呈正相关。　　在属水平上，丁酸含量降低主要与理研菌科的Alistipes属；毛螺旋菌科的 Roseburia属、Blautia属、Lachnospiraceae UCG-005属、Lachnospiraceae FCS020 group属；瘤胃球菌科的 Ruminococcaceae UCG-003属、Ruminococcus1属呈正相关。戊酸含量降低主要与理研菌科的Alistipes属、瘤胃球菌科的Eubacterium coprostanoligenes group属、Ruminococcaceae UCG-002属、Ruminococcaceae UCG-003属、Ruminococcaceae NK4A214 group属、Ruminococcaceae1属；毛螺旋菌科的Eubacterium ruminantium group属；消化球菌科的Peptococcus属呈正相关。　　6.肠道菌群与CD4+、CD8+T细胞数及CD4/CD8比值的相关性：我们未发现与CD4+T细胞呈相关性的菌群。与CD8+T细胞呈正相关的主要菌群有：变形菌门下的Oxalobacer、Undibacterium、Burkholderia、Achromobacter、Ramlibacter属；拟杆菌门下Sphingobacteriia科。　　7.短链脂肪酸与CD4+、CD8+T细胞数及CD4/CD8比值的相关性：CD4+T细胞、CD4/CD8比值与乙酸呈负相关，CD8+T细胞与戊酸呈正相关。　　结论：　　1. HIV感染者在尚未进入艾滋病期，发生消化道症状前，肠道微生态环境可能已经与健康者存在差异；　　2. HIV感染者的重要肠道粘膜保护因素较健康者降低，如罗氏菌属Roseburia、毛螺旋菌属Lachnospiraceae、Alistipes菌属、瘤胃球菌属Ruminococcaceae、理研菌科Rikenellaceae等的菌群负荷降低，相关细菌的代谢产物丁酸和戊酸水平下降；　　3. HIV感染者肠道粘膜的破坏性因素增加，如变形菌门中的莫拉菌科Moraxellaceae和冷杆菌属 Psychrobacter丰度在肠腔中显著升高，推测其可能与菌群易位密切相关，从而诱导持续的炎症反应，加重HIV病程的发展；　　4.尚未发展至AIDS期的HIV感染者的细胞免疫水平与肠道菌群分布不一定具有相关性；　　5.尚未发展至AIDS期的HIV感染者的细胞免疫水平与肠道各短链脂肪酸SCFAs水平相关性不明确。

目录

前言

一、HIV感染与肠黏膜功能受损

二、HIV感染与肠道微生态

材料和方法

1 主要试剂:

2 主要仪器:

3 实验方法

结果

1.微生物16s片段高通量测序分析结果：

2. 粪便短链脂肪酸定量结果

3.肠道损伤标志物I-FABP和D-乳酸定量结果

4.HIV感染者的CD4+、CD8+T细胞和CD4/CD8值

5.肠道菌群与丁酸、戊酸的相关性结果：

6.肠道菌群与HIV感染组的CD4+、CD8+T细胞、CD4/CD8比值的相关性结果：

7.短链脂肪酸与HIV感染组的CD4+、CD8+T细胞、CD4/CD8比值的相关性结果：

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:短链脂肪酸的研究进展

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