血清糖蛋白糖基化分析技术研究及其在原发性肝癌诊断中的应用

摘要

原发性肝癌是目前威胁人类健康的主要恶性肿瘤类型之一。在我国，肝癌的发病率处于所有恶性肿瘤的第四位，死亡率位居第三位。由于大部分患者确诊时肿瘤已处于中晚期，手术治疗后复发率、转移率高，因而远期生存质量差，五年生存率低。早期诊断、早期干预对肝癌患者的预后改善至关重要。血清甲胎蛋白(AFP)是目前最常用的肝癌诊断标志物。但其敏感性仅为60～70％，且在部分肝脏良性疾病中表达上升，诊断效能不能满足临床需要。因此，寻找更加理想的生物标志物或多参数诊断模型是肝癌诊疗研究的重要方向。此外，对于影响肝癌预后的重要病理因素，采用血清无创性检测方法做出预测，对患者的个体化诊疗和临床医生治疗方案的制定具有重要价值。　　既往的肿瘤生物标志物研究主要集中在蛋白及核酸研究中，忽略了糖链或聚糖这类重要的生物大分子。糖链通过共价结合的方式连接在蛋白多肽骨架的特定氨基酸上的过程称为蛋白质糖基化。N-糖基化和O-糖基化是两种主要的糖基化类型。人体内大约70％的蛋白质是糖蛋白。糖基化是最常见、最复杂的蛋白质翻译后修饰形式，对蛋白的结构和功能具有重要的调节作用。糖链的功能涉及细胞粘附、细胞间相互作用、信号转导、免疫调节等一系列生物学过程。大量研究表明:聚糖直接参与了人类几乎所有重大疾病包括肿瘤的病理生理学过程。因此，对糖科学知识的了解为疾病相关的基础和临床研究提供了一个新的角度，糖组学、糖蛋白质组学、糖生物学逐渐受到关注。目前临床使用的肿瘤标志物大部分是糖蛋白，包括AFP、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)等。研究癌症相关的特征性糖链对肿瘤的诊断、病程监测、预后评估及靶向治疗具有重要价值。但是糖链的复杂性及多样性为相关结构与功能研究带来巨大挑战，糖科学的发展远远落后于基因组学及蛋白组学。　　本研究采用目前主流的糖基化研究技术包括质谱、毛细管电泳等对血清特定蛋白来源的N-糖链、总血清池N-糖链结构进行分析，探究其对肝癌的诊疗价值。尝试建立位点特异的N-糖肽分析方法，对糖基化的微观不均一性进行表征。同时，通过转录组测序对异常糖基化相关的调控机制进行初步探索。　　第一部分:血清IgG来源的N-糖链结构分析及其在原发性肝癌中的诊断价值研究　　本部分采用基于基质辅助激光解吸电离-质谱的分析方法对对不同病因来源的肝细胞癌(HCC)、肝硬化(LC)患者血清中IgG来源的糖链进行鉴定与比较。结果表明:肝癌发生过程中，血清IgG上主要的糖链结构会发生改变。总体上，与LC患者相比，HCC患者血清IgG上N-糖链的半乳糖基化水平呈下降趋势。不同的糖链结构在HCC和LC中是否存在显著性差异与病因学因素有关。对于HCV相关的HCC患者，部分糖链结构与临床病理指标如肿瘤大小、TNM分期等存在相关性。此外，血清IgG来源的N-糖链对HCC特别是AFP阴性的HCC患者具有重要的补充诊断价值。　　第二部分:血清蛋白N-糖谱与HBV相关HCC患者临床病理特征的相关性研究　　本部分采用快速、高通量的DSA-FACE技术对HBV相关的HCC患者血清蛋白N-糖表达谱进行分析，并探讨与临床病理指标间的关系。结果表明:血清聚糖结构的丰度与微血管侵犯(MVI)、肿瘤大小、门静脉癌栓(PVTT)、肝硬化、分化情况等重要的临床病理因素具有相关性。同时，尽管N-糖结构和相应的诊断模型对MVI的预测能力并不理想，但其诊断效能并不低于经典的标志物AFP。通过病例随访及数据分析发现，Peak12(NA4Fb，含一个分支岩藻糖的四天线聚糖结构)是患者术后复发的独立危险因素，Peak9'(NA3F，核心岩藻糖基化的三天线聚糖结构)、Peak12是术后死亡的独立危险因素。　　第三部分:基于LC-MS的位点特异的N-糖肽分析方法研究　　本部分以血清Alpha-1抗胰蛋白酶(A1AT)和纤连蛋白(Fibronectin)为研究靶蛋白，采用液相色谱-质谱技术探索建立血清糖蛋白位点特异的N-糖肽分析方法，实现对A1AT和Fibronectin糖基化的微观不均一性的表征。同时，采用免疫沉淀的方法纯化HCC和LC患者血清A1AT并进行位点特异的N-糖肽分析，发现三种差异糖肽结构，为更加精确的揭示肿瘤发生发展过程中蛋白的糖基化异常提供参考。　　第四部分肝癌细胞株（SMMC-7721）中Alpha-1，6岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲除及转录组测序　　本部分在肝癌细胞株SMMC-7721中对核心岩藻糖结构形成的关键酶Alpha-1，6岩藻糖基转移酶(FUT8)进行敲除及验证。同时，对敲除前后的细胞采用Illumina Hiseq平台进行转录组测序，采用荧光定量PCR对测序数据进行验证。通过生物信息学分析对211个差异基因的功能进行注释并对涉及的主要信号通路（PI3K/AKT通路等）进行富集，为肝癌异常糖基化调控的分子机制研究提供线索。　　综上，本课题综合采用多种研究方法，在多个层面对血清特定蛋白的N-糖链、血清总蛋白N-糖表达谱及完整的N-糖肽进行分析，寻找与肝癌相关的异常糖基化结构，为糖科学在肿瘤临床诊疗中的应用提供依据。此外，通过转录组测序对异常糖基化的调控网络进行了初步探索，相关机制还需要进一步研究。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一部分 血清IgG来源的N-糖链结构分析及其在原发性肝癌中的诊断价值研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分 血清蛋白N-糖谱与HBV相关HCC患者临床病理特征的相关性研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第三部分 基于LC-MS的位点特异的N-糖肽分析方法研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第四部分 肝癌细胞株(SMMC-7721)中Alpha-1，6岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲除及转录组测序

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

研究工作小结

文献综述一

文献综述二

发表论文、参加学术会议及参研课题情况

致谢