钙离子通道蛋白TRPV6对小鼠骨代谢和破骨细胞形成的调控作用及其机制研究

摘要

骨质疏松症是由多种原因引起的骨密度和骨质量下降的代谢性疾病，现全球骨质疏松的患者约2亿人，中国超过9000万患者，全球每年因骨质疏松导致骨折的患者约890万，每年用于骨质疏松治疗的医药费用约250亿元，这给患者带来严重痛苦，给家庭和社会带来沉重负担。因此，骨质疏松的预防和治疗是一项急需解决的医学问题。骨组织代谢平衡紊乱，破骨细胞骨吸收功能的异常，是导致骨质疏松的主要病理基础之一，因此，研究调控破骨细胞骨吸收功能的相关因子和信号通路，有助于深入了解骨质疏松的发病机制，对于骨质疏松的防治，具有重要的科学意义和医学价值。　　瞬时性受体电位通道香草酸受体(Transient Receptor Potential Vanilloid，TRPV)是一类钙离子转运蛋白。其家族共有六个成员，包括TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRVP4、TRPV5、TRPV6，其中TRPV5和TRPV6被称为高选择性钙离子通道蛋白，最近研究发现，TRPV6是破骨细胞上重要的钙离子通道，其可通过调节细胞内钙离子浓度，参与调控骨代谢功能，然而，TRPV6对骨代谢的调节作用仍存在争议，目前对TRPV6参与RANKL诱导的破骨细胞分化的研究还很少，其调控破骨细胞形成，骨吸收的分子机制尚不清楚。　　目的与方法:　　课题组前期成功建立了TRPV6基因敲除小鼠的动物模型，这为本课题的顺利开展提供了有利条件。本次研究从在体动物实验出发，利用Micro-CT扫描及三维重建，四环素双标和TRAP染色，酶联免疫吸附实验，蛋白质印迹实验等方法，阐明钙离子通道蛋白TRPV6对于小鼠骨代谢的影响;通过离体细胞实验，通过细胞TRAP染色，骨吸收陷窝实验，细胞免疫荧光实验，慢病毒转染，钙离子振荡实验，蛋白质印迹实验，实时定量PCR等相关实验方法，研究TRPV6在破骨细胞中的表达分布及其对破骨细胞的调控作用，并从分子水平，深入探索TRPV6调控破骨细胞形成，骨吸收的机制和相关信号通路。　　结果:　　我们的研究发现，12周龄TRPV6-/-小鼠可发生骨质疏松，Micro-CT扫描12周龄小鼠股骨样本，发现TRPV6-/-小鼠骨密度及骨小梁数量明显低于同龄普通野生型(WT)小鼠，CT三维重建可视TRPV6-/-小鼠股骨样本骨小梁变细，排列变稀疏。两组(WT和TRPV6-/-)小鼠股骨切片四环素双标染色未见明显差异，且Micro-CT扫描分析两组小鼠骨形成活力的指标无明显差异，提示TRPV6-/-小鼠成骨能力与普通野生型小鼠相比无明显异常。股骨切片免疫组化TRAP染色，TRPV6-/-小鼠染色面积明显大于对照组（WT组），ELISA试剂盒检测发现，TRPV6-/-小鼠血清Ⅰ型胶原交联C端肽(CTX-1)浓度明显高于对照组（WT组），提示TRPV6-/-小鼠骨吸收能力强于对照组(WT组)，即TRPV6缺乏可引起小鼠骨吸收能力异常（增高），导致骨质疏松。　　体外细胞研究发现，小鼠破骨细胞可表达TRPV6蛋白，且伴随着破骨细胞分化成熟的进程，TRPV6蛋白的表达量越来越低;通过细胞免疫荧光染色，可确定TRPV6主要分布在破骨细胞的细胞膜上，胞浆和胞核仅有少量分布。之后，课题组利用TRPV6-/-小鼠来源的原代破骨细胞，以及RNAi技术沉默普通小鼠来源破骨细胞的TRPV6基因，通过细胞形态学观察、TRAP染色、骨吸收陷窝实验，QT-PCR等检测方法，研究TRPV6对破骨细胞形成，骨吸收的调控作用，结果发现TRPV6可以负向调控破骨细胞形成，降低破骨细胞分化标志基因(CathepsinK、TRAP)和融合标志基因（Atp6v0d2、DC-STAMP）的表达，抑制骨吸收。　　为深入探索TRPV6负向调控破骨细胞形成的机制，通过钙离子振荡实验对可能参与其中的信号通路进行了初步筛选，发现沉默TRPV6基因不影响破骨细胞Ca2+振荡，证明TRPV6通过非Ca2+振荡/CaN依赖性通路抑制破骨细胞分化。IGF信号通路作为一条非Ca2+振荡/CaN依赖性信号通路，在破骨细胞的分化中起着重要作用。于是，课题组推测IGF可能介导TRPV6对破骨细胞形成，骨吸收的调控。结果证实，应用RNAi技术沉默TRPV6基因后，破骨细胞IGF1RmRNA和IGFBP1mRNA转录水平明显增高，且破骨细胞中IGF1R和IGFBP1蛋白表达量也明显升高，而阻断IGF信号通路可明显减弱TRPV6对破骨细胞形成的抑制作用。　　PI3K-AKT通路是IGF信号通路下游的信号途径之一，为明确该条通路是否参与TRPV6对破骨细胞形成的负向调控，课题组对此条通路进行了验证。结果提示，TRPV6可抑制破骨细胞PI3K-AKT途径中P85/p-P85、PDK1/p-PDK1和AKT/p-AKT的蛋白表达，加入拮抗剂NVP-AEW541阻断IGF1R后，TRPV6对上述通路中磷酸化标志蛋白的抑制作用消失，提示TRPV6通过抑制IGF1R-PI3K-AKT通路负向调控破骨细胞形成和骨吸收。　　结论:　　综上所述，本次研究，结合在体动物实验和体外细胞实验，发现TRPV6对小鼠骨代谢具有重要的调节作用，TRPV6基因敲除小鼠发生骨质疏松的主要原因是骨吸收功能异常导致，TRPV6是破骨细胞重要的调节因子，具有负向调控破骨细胞形成，骨吸收的作用，该作用主要依靠非Ca2+振荡/CaN依赖性通路介导，TRPV6通过抑制IGF1R-PI3K-AKT信号通路，负向调控破骨细胞形成，骨吸收。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、TRPV6对骨代谢及破骨细胞形成的调节作用

二、IGF信号通路介导TRPV6调控破骨细胞形成的机制研究

参考文献

材料和方法

一、主要实验材料

二、主要实验方法

实验结果

一、TRPV6基因敲除小鼠模型鉴定

二、TRPV6基因敲除小鼠可发生骨吸收异常，导致骨质疏松

第二部分TRPV6基因对小鼠破骨细胞形成的调控作用

一、小鼠破骨细胞的分离培养和鉴定

二、TRPV6在小鼠破骨细胞中的表达和分布

三、TRPV6抑制小鼠破骨细胞形成和骨吸收

第三部分TRPV6基因负向调控小鼠破骨细胞形成及骨吸收的机制研究

一、IGF信号通路介导TRPV6抑制小鼠破骨细胞形成及骨吸收

二、TRPV6通过抑制IGF1R-PI3K-AKT信号通路负向调控小鼠破骨细胞形成及骨吸收

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文及参加科研工作情况

致谢