羊膜上皮细胞调控糖尿病创面再上皮化及肉芽组织形成的研究

摘要

研究背景　　我国目前有超过1.1亿的糖尿病患者，排名世界首位。约25％的患者在其患病的某一时期会并发糖尿病足部溃疡。临床上常常采用在控制血糖的基础上，给予创面彻底清创换药、控制局部感染、周围血管再通、手术修复等方法，效果往往有限，最终只能靠截肢来救治的大约占14-25%，而截肢后的五年生存率仅为40-50%。糖尿病创面因其高发病率、创面迁延不愈、容易复发、截肢率高等因素，给患者、医院和整个社会都带来了严重的痛苦和负担。因此临床急需新型有效的治疗手段促进糖尿病创面的愈合。　　人羊膜来自胎盘最内层，为人体内最厚的基底膜，是不含有神经、血管、淋巴等组织的具有五层结构的半透膜。羊膜作为生物敷料在创面愈合中的应用已经有了一百多年的历史。其促进创面愈合是通过抗感染、降低创面炎症反应、促进创面再上皮化、减轻瘢痕形成等作用来实现。人们发现羊膜中的羊膜上皮细胞能表达干细胞的多种表面标记物，具有向三个胚胎层细胞系分化的潜能；能通过旁分泌功能释放多种细胞因子；还具备低免疫原性、免疫调节能力、低成瘤性、取才方便，不受伦理制约等优势，已经在心血管疾病、肝脏疾病、呼吸系统疾病、帕金森、口腔修复、组织工程化皮肤等领域中得到广泛应用，在干细胞治疗和再生医学中发挥着越来越重要的作用。但是人羊膜上皮细胞如何调控糖尿病创面愈合的应用研究鲜有报道。　　在本课题实验研究中，我们体外分离培养人羊膜上皮细胞，将其移植至全层皮肤缺损的糖尿病小鼠模型中，评价其对创面愈合中再上皮化和肉芽组织生成的作用和影响，并初步探讨其作用机制。　　第一部分 人羊膜上皮细胞培养鉴定及干细胞特性检测研究　　目的：培养人羊膜上皮细胞进行生物学特性与干细胞性能鉴定。　　方法：收集人新鲜羊膜，采用酶消化法获得羊膜上皮细胞，体外传代培养；经流式细胞仪计数并测定人羊膜上皮细胞表型；采用免疫荧光法测定人羊膜上皮细胞干性标志物表达；诱导人羊膜上皮细胞向三个胚层分化，检测其多向分化潜能。　　结果：镜下观察人羊膜上皮细胞呈椭圆形或多边形，中央明显凸出而边缘扁平，轮廓较清楚，以鹅卵石样集落生长，贴壁牢固。传代后细胞生长速度减慢，增殖能力降低，传至P3代基本不再增殖。流式细胞仪检测发现羊膜上皮细胞表面标志物CD105、CD90、CD73、CD44、CD29等高表达，而CD45、CD34等表面标志物低表达。免疫荧光法测定发现人羊膜上皮细胞能表达OCT4、SSEA-4等干性标志物。诱导分化实验证实人羊膜上皮细胞能被诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞，具有多向分化潜能。　　结论：从羊膜中分离培养的细胞为人羊膜上皮细胞，具有干细胞特性。　　第二部分：人羊膜上皮细胞在糖尿病创面动物模型中的应用研究　　目的：探讨人羊膜上皮细胞在小鼠糖尿病创面中的作用。　　方法：动物模型为db/db鼠全层皮肤缺损创面，于创面分别给予羊膜上皮细胞注射及PBS注射（空白对照组）。观察计算比较两组创面的大体形态、创面愈合率；HE染色后观察创面病理学组织结构、计算创面再上皮化率及肉芽组织厚度；Western Blot方法检测两组创面I型、III型胶原表达。　　结果：（1）人羊膜上皮细胞注射组在创面第7及12d时创面愈合率较空白对照组显著增加（P＜0.01）；（2）创面第7d人羊膜上皮细胞组的创面再上皮化速度较空白对照组明显增加（P＜0.01），肉芽组织厚度也较空白对照组明显增加（P＜0.01）；（3）与空白对照组相比，人羊膜上皮细胞组I型、III型胶原表达明显高于空白对照组。　　结论：人羊膜上皮细胞可以提高糖尿病小鼠创面愈合率、加快创面再上皮化速度、增加创面肉芽组织厚度及促进创面I型和III型胶原生成。　　第三部分：人羊膜上皮细胞调控糖尿病创面愈合中再上皮化及肉芽组织形成的机制研究　　目的：研究人羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用机制　　方法：收集人羊膜上皮细胞条件培养基，设置三个实验组：人羊膜上皮细胞条件培养基组；阴性对照为高糖DMEM培养基组；阳性对照为10%FBS高糖DMEM培养基组。以各组培养基分别培养表皮细胞、成纤维细胞。通过CCK-8法测定各组表皮细胞、成纤维细胞增殖情况；划痕实验及Transwell小室测定各组表皮细胞、成纤维细胞迁移能力；RT-PCR检测各组成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达；蛋白芯片检测人羊膜上皮细胞条件培养基内生长因子表达情况。　　结果：（1）通过CCK-8试剂盒检测发现培养于人羊膜上皮细胞条件培养基的表皮细胞、成纤维细胞的增殖活性较阴性对照组明显增加（P＜0.01）；（2）通过细胞划痕实验检测发现人羊膜上皮细胞条件培养基组的表皮细胞、成纤维细胞的创面愈合率较阴性对照组明显增加（P＜0.01）；（3）通过Transwell小室迁移实验检测发现人羊膜上皮细胞条件培养基组的表皮细胞、成纤维细胞的细胞迁移能力较阴性对照组明显增多（P＜0.01）；（4）通过RT-PCR检测，人羊膜上皮细胞条件培养基组的成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达较空白对照组明显增高（P＜0.01）；（5）应用人生长因子蛋白芯片检测出人羊膜上皮细胞条件培养基可以表达41种生长因子，其中AR、EGF、CSF3、CSF2、HB-EGF、IGFBP-2、CSF1R、NT-3、PDGFR、PDGFR-A、TGF-β1及VEGFR3因子高表达。　　结论：人羊膜上皮细胞通过旁分泌多种生长因子促进表皮细胞、成纤维细胞的增殖、迁移能力，诱导再上皮化及肉芽组织形成，进而促进糖尿病创面愈合。

目录

缩略词表

引言

第一部分 人羊膜上皮细胞培养鉴定及干细胞特性检测研究

一、前言

二、实验材料

（一）主要实验仪器

（二）主要实验试剂

（三）主要试剂制备

三、实验方法

（一）体外分离培养人羊膜上皮细胞

（二）鉴定人羊膜上皮细胞表型

（三）测定人羊膜上皮细胞干性标志物

（四）人羊膜上皮细胞分化能力测定

（五）统计方法

四、实验结果

（一）观察人羊膜上皮细胞生长情况

（二）人羊膜上皮细胞的表型分析

（三）人羊膜上皮细胞干性标志物检测

（四）人羊膜上皮细胞分化能力鉴定

五、讨论

第二部分 人羊膜上皮细胞在糖尿病创面动物模型中的应用研究

一、前言

二、实验材料

（一）主要实验仪器

（二）主要实验试剂

（三）主要试剂制备

（四）实验动物

三、实验方法

（一）建立糖尿病创面的动物模型

（二）创面处理及观察

（三）创面标本病理组织学检测

（四）蛋白免疫印记法检测创面胶原表达

（五）统计方法

四、实验结果

（一）人羊膜上皮细胞能提高创面愈合率

（二）人羊膜上皮细胞能促进创面再上皮化及肉芽组织形成

（三）人羊膜上皮细胞促进创面I型、III型胶原生成

五、讨论

第三部分 人羊膜上皮细胞调控糖尿病创面愈合中再上皮化及肉芽组织形成的机制研究

一、前言

二、实验材料

（一）主要实验仪器

（二）主要实验试剂

（三）主要试剂制备

三、实验方法

（一）制备人羊膜上皮细胞条件培养基

（二）原代成纤维细胞、表皮细胞分离培养

（三）CCK-8法测定细胞增殖活性

（四）细胞划痕实验检测细胞迁移能力

（五）Transwell小室检测细胞迁移能力

（六）RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达情况

（七）蛋白芯片检测人羊膜上皮细胞条件培养基生长因子表达

（八）统计方法

四、实验结果

（一）人羊膜上皮细胞条件培养基对表皮细胞的调控作用

（二）人羊膜上皮细胞条件培养基对成纤维细胞的调控作用

（三）人羊膜上皮细胞条件培养基内生长因子表达情况

五、讨论

全文总结

综述:人羊膜上皮细胞在干细胞治疗中的研究进展

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢