Metrnl对小鼠认知功能的影响及机制研究

摘要

认知是指生物体通过思考、经验或者感官获得知识和认识的心理行为或过程。随着人口老龄化的加剧，以阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)为首的导致认知功能下降的疾病成为老年人群亟待解决的问题。认知功能的下降不仅给患者自身和家庭带来痛苦，也给社会造成了沉重的经济负担。然而目前为止，尚无公认有效的可以提高认知功能的药物问世。Metrnl是本实验室在2014年发现的一种全新的脂肪因子，具有多种生物学功能。根据2009年Surace C等对于人类Mild ring17syndrome的病例报告，该病所表现出的认知功能的改变是由于17号染色体在环化的过程中丢失了端粒附近包括METRNL在内的四个基因所致的。这使得对于Metrnl是否与认知功能有关产生了浓厚兴趣。目前为止，Metrnl在中枢神经系统中的功能尚未完全阐释清楚，能否影响啮齿类动物的认知功能还未见报道。　　目的：　　建立和评估D-半乳糖[D-(+)galactose，D-gal]模型;探究Metrnl对小鼠认知功能的影响及作用机制。　　方法：　　一、通过连续腹腔注射D-gal生理盐水溶液8w（剂量:100mg/Kg）构建小鼠D-gal模型，用Morris水迷宫实验评价Metrnl全身敲除小鼠在生理及D-gal模型状态下的学习和记忆功能;继而检测脑组织中记忆相关蛋白分子及炎症因子等指标，阐述模型的作用机制并探究Metrnl的作用机制。　　二、采用不同剂量D-gal探索体外D-gal模型的量效关系，确立模型的构建方法，阐述模型的作用机制，继而考察在Metrnl过表达、敲减及外源性给予重组蛋白情况下对三种不同细胞:海马区神经元、星形胶质细胞和BV-2细胞系的作用，检测与记忆相关蛋白分子或炎症因子等指标，进一步探究Metrnl的作用机制。　　结果：　　一、D-gal模型的建立和评估　　（一）2月龄小鼠学习和记忆功能存在一定程度的性别差异，雄性动物略好于雌性动物，在实验过程中应注意性别区分。　　（二）成年小鼠D-gal模型的学习和记忆功能受到损害，小鼠大脑中BDNF、GFAP、Synaptophysin、PSD-95等记忆相关蛋白分子的含量明显减少，Trk-B受体含量反射性增加;同时，小鼠大脑中caspase-3含量明显升高，说明神经细胞凋亡增多;此外，与氧化应激损伤相关的指标GSH-px和MDA也明显增加，说明D-gal代谢产物的积累导致小鼠大脑氧化应激损伤。　　（三）细胞D-gal模型中，海马区神经元在药物浓度10mg/mL，给药48h后可以出现明显的细胞毒性反应和氧化应激损伤，但是不会引起细胞形态的变化;海马区星形胶质在药物浓度3～10mg/mL，给药48h后也可以出现上述改变;BV-2细胞系在药物浓度3～10mg/mL，给药24h后即可出现明显的炎症反应。D-gal刺激可诱导神经元和星型胶质细胞保护性分泌BDNF，在高浓度剂量时可以导致神经细胞发生形态学改变。　　一、Metrnl对小鼠认知功能的影响及机制研究　　（一）Metrnl在成年小鼠海马区的表达高于大脑皮层。Metrnl全身敲除小鼠（Metrnl knockout mice，KO）与野生型对照小鼠(Metrnl wild type mice，WT)相比没有明显的学习和记忆功能的下降，但KO小鼠GFAP在脑中的含量比WT明显减少。　　（二）D-gal模型中KO小鼠的学习能力明显下降，记忆能力也有所降低。进一步研究发现Metrnl可以在D-gal模型早期参与调控小鼠海马区BDNF等蛋白质的水平。但是KO和WT小鼠N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)以及JAK-STAT3通路上蛋白质水平的变化没有区别。　　（三）细胞D-gal模型表明，Metrnl并不直接作用于海马区神经元，而是通过海马区的星形胶质细胞发挥调控作用。Metrnl对海马区星形胶质细胞有明显的神经营养作用。此外，Metrnl可以调控海马区星型胶质细胞及BV-2细胞系D-gal模型多种炎症因子的表达，缓解模型的炎症反应，这也可能是Metrnl保护大脑学习和记忆功能的机制之一。　　结论：　　Metrnl在成年小鼠海马区的表达量高于大脑皮层，在生理条件下对于成年小鼠学习和记忆功能的影响并不明显，然而Metrnl敲除小鼠全脑GFAP含量明显降低。在D-gal模型中，Metrnl敲除小鼠学习和记忆功能受损;海马区与记忆相关蛋白分子的水平下降，且在模型早期(7d)即可出现。Metrnl对于海马区神经元的神经营养作用并不明显，但是在D-gal模型中可以促进海马区星形胶质细胞BDNF的表达和分泌，发挥明显的神经营养作用。同时，Metrnl可以调节海马区星型胶质细胞及BV-2细胞系D-gal模型炎症因子的表达，减弱D-gal模型的炎症反应，这也可能是Metrnl缓解小鼠D-gal模型学习和记忆功能下降的原因之一。Metrnl在海马区的特殊分布和作用可能成为治疗或者缓解AD早期病变的新靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、不同性别小鼠的学习和记忆功能

二、Metrnl敲除小鼠的学习和记忆功能及相关指标的检测

三、小鼠D-gal模型的学习和记忆功能及相关指标的检测

四、Metrnl敲除小鼠D-gal模型的学习和记忆功能及相关指标的检测

五、血管内皮细胞Metrnl特异性敲除小鼠D-gal模型的学习和记忆功能

六、Metrnl敲除小鼠D-gal模型记忆相关蛋白分子指标的检测

七、离体细胞D-gal模型的制备

八、Metrnl在离体细胞D-gal模型中的作用

讨论

结论

参考文献

附录

综述

攻读硕士学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢