Junctophilin--2调节心房肌细胞内钙稳态及心房重构影响房颤发生的作用机制研究

摘要

研究目的：　　（一）明确JP2及Calpain-1在房颤患者及实验性房颤模型中的表达规律　　（二）阐明Calpain-1抑制剂通过调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制　　（三）探讨JP2蛋白水平变化影响小鼠房颤易感性的作用及机制研究　　研究方法：　　（一）Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化规律研究　　1.收集于我科行体外循环下冠状动脉搭桥术或者二尖瓣外科手术患者的心房肌标本，其中术前诊断为持续性AF者28例，维持正常窦性心律（normal sinus rhythm，NSR)者16例，于体外循环转机前采集标本，迅速转移至医院生物样本库。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化，以及Calpain-1酶活性的变化情况。　　2.选取共计18只成年新西兰大白兔（2.0～2.5kg，雄性）为实验对象，按照随机数法分别纳入假手术组(sham)和RAP组(2w、4w)，其中每组6只。沿胸骨左缘第3肋间打开胸腔，暴露心脏，将起搏电极头端缝合固定于左心房游离壁.起搏电极尾端缝合固定于胸腹壁位置上并通过皮下与起搏器相接。起搏器起搏模式为AOO，刺激频率为1000bpr，连续刺激4w,以建立快速心房起搏(rapid atrial pacing，RAP)兔AF模型。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化，以及Calpain-1酶活性的变化情况。　　（二）Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究　　1.实验动物的选择及分组　　本实验中，采用诱导性基因调控“Tet-off”系统构建心脏特异性Calpain-1过表达小鼠（CAPN1-OE）模型，作为房颤小鼠实验模型。在该系统中融合表达四环素(Tetracycline，Tet)调控的转录激活子（tet-controlled transcriptional activator,tTA），在缺少四环素或者强力霉素(doxycycline，Dox)时，tTA可以激活目的质粒转录;在四环素或者强力霉素作用下，缺少增强子使目的基因表达量很低或无法表达。　　开展作用及机制研究的时间点为撤除Dox药物饲料（即Tet-off系统开始目的基因过表达）后8周。在该时间点，分为以下三组，即对照组（control），Calpain-1过表达组（CAPN1-OE），以及Calpain-1过表达同时给予Calpain抑制剂(MDL28170，10mg/kg，1/日，腹腔注射)处理组(CAPN1-OE+MDL)。　　本部分纳入实验小鼠共计75只，其中选择无Calpain-1过表达的αMHC-tTA小鼠（Calpain/tTA-/+）作为对照组，雌雄不限，共计25只;选择心脏特异性Calpain-1过表达组小鼠（Calpain/tTA+/+），雌雄不限，共计50只，采用随机数字法分为CAPN1-OE组和CAPN1-OE+MDL组，每组25只。　　2.Calpain抑制剂调控小鼠房颤易感性的作用研究　　采用STG-3008型多通道电刺激器（MultiChannel Systems，Germany），通过连接Millar1.1F多电极电生理导管(EPR-800，Millar Instruments)，外接Labchart Pro信号采集系统(AD Instruments，Australia)同时记录心脏表面电信号和体表心电图，明确食管腔内电刺激导管的合适位置，开展经食管心脏程序性电刺激和记录。　　采用经食管心脏程序性电刺激方法检测各组小鼠AF的诱发率和持续时间的变化情况。　　3.标本收集　　完成相应电生理检测后，处死小鼠收集心脏标本，用于后续分子生物学、共聚焦成像等实验研究。采用Western blot检测各组心房组织JP2表达变化;采用活性检测试剂盒，评估各组心房组织Calpain1的酶活性。　　研究结果：　　（一）Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化及相关性研究　　1.房颤患者心肌标本中JP2及Calpain-1的表达规律　　持续性房颤患者心房肌组织中JP2蛋白表达水平显著下降，Calpain-1蛋白水平及其酶活性均显著升高，心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显著负相关。　　2.快速心房起搏兔房颤模型中JP2及Calpain-1的表达规律　　在RAP兔房颤模型中，随着高频心房起搏时程延长，心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐下降，Calpain-1蛋白水平及酶活性逐渐升高，心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显著负相关。　　（二）Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究　　1.Calpain抑制剂显著改善CAPN1-OE小鼠异常升高的房颤易感性　　同对照组小鼠相比，CAPN1-OE8周组小鼠其房颤的诱发率显著升高，房颤事件持续时长明显延长。而在撤除Dox药物饲料即日起，开始腹腔注射Calpain抑制剂MDL28170，结果提示，CAPN1-OE+MDL处理组中，小鼠房颤诱发率、持续时间的异常升高均明显改善。　　2.Calpain抑制剂显著改善CAPN1-OE小鼠心房肌Calpain-1的过度激活　　同对照组小鼠相比，CAPN1-OE小鼠心房肌组织Calpain1的酶活性显著升高，伴有JP2蛋白表达水平明显下降，而CAPN1-OE+MDL小鼠心房肌组织中的Calpain1的酶活性显著降低，而JP2蛋白表达水平得以明显恢复。　　3.Calpain抑制剂显著改善CAPN1-OE小鼠心房肌细胞异常钙稳态　　同对照组小鼠相比，CAPN1-OE8周组小鼠心房肌细胞钙火花异常增多;采用心脏整体钙成像技术检测发现心房肌中异常钙波发生频率明显增多。CAPN1-OE+MDL处理组中，上述钙火花频率增高等异常钙稳态现象明显改善，而在心脏整体灌流钙荧光指示剂染色成像中，结果提示MDL处理可以明显改善CAPN1-OE小鼠心房肌的钙稳态异常。　　（三）JP2蛋白水平变化调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究　　1.成功建立了Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型　　在该部分，首先建立了心肌特异性JP2过表达小鼠(JP2-OE)。与对照组小鼠相比，在撤除Dox药物饲料4周，即JP2过表达激活4周时，JP2-OE小鼠的心房肌组织中JP2的蛋白表达水平显著增高;将JP2-OE小鼠与CAPN1-OE小鼠杂交，即可得到Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型（CAPN1-OE×JP2-OE）。　　2.在撤除Dox药物饲料4周时，心脏超声结果提示各组小鼠左室功能未见明显异常　　超声心动图结果显示，对照组小鼠，CAPN1-OE小鼠以及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠等3组小鼠，其左室射血分数LVEF，收缩末左室容积ESV，以及舒张末左室容积EDV等未见显著差别;取小鼠心脏、肺脏等称重后，各组小鼠心脏重量/体重HW/BW、肺脏重量/体重LW/BW的变化情况等未见显著差别。　　3.在撤除Dox药物饲料8周时，CAPN1-OE小鼠以及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠均出现较明显的左室功能受损　　超声心动图结果显示，同对照组小鼠相比，CAPN1-OE小鼠以及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠等，其LVEF显著下降，而ESV及EDV等指标显著升高，提示存在明显的左心收缩舒张功能障碍;此外，CAPN1-OE小鼠以及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠等HW/BW显著增大，但LW/BW未见显著差别，提示存在显著的心脏肥厚，但未见明显的肺脏淤血等。　　研究结论：　　1.在房颤患者及房颤实验模型中，随着心房快速刺激持续存在，心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐降低，而Calpain-1表达明显上调且其酶活性显著激活，且心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显著负相关;　　2.在CAPN1-OE小鼠房颤模型中，JP2蛋白是Calpain-1重要降解底物之一。在Calpain-1蛋白过表达8周时，MDL28170通过显著抑制Calpain-1酶活性，并改善心房肌蛋白JP2的表达水平，显著改善房颤的易感性;　　3.心房肌细胞JP2蛋白的变化，可通过调节房颤小鼠心房肌细胞钙稳态（钙火花、钙波等钙异常释放事件），进而影响心房电重构（AERP变化、T管结构重构）及结构重构（心房腔扩大、心房纤维化），从而影响小鼠房颤易感性（房颤的发生率及持续时间）;JP2-OE作为潜在的治疗房颤的可能手段，其调控房颤易感性的作用有一定的时程性。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分 JP2及Calpain-1在房颤患者及实验性房颤模型中的表达规律

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

参考文献

第二部分 Calpain抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

参考文献

第三部分JP2调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

参考文献

全文总结

综述

攻读学位期间发表论文和科研工作情况

致谢