白蛋白同型半胱氨酸化诱导高未结合胆红素血症的机制研究

摘要

研究目的:　　高胆红素血症是指由各种原因导致的血清胆红素水平出现增高的现象。其中，新生儿高胆红素血症是新生儿临床最常见的疾病之一，其发病率和住院率居新生儿住院疾病的首位。重度高胆红素血症可对机体多器官和组织造成病理损伤作用，特别是胆红素脑病（核黄疸），具有极高的病死率和致残率。既往主要以血清总胆红素(TB)水平作为评价高胆红素血症毒性的关键指标。但随着对高胆红素血症研究的进展，学者们一致认为血清TB水平受机体状态和内环境等因素影响，在预测高胆红素血症对机体毒性损伤方面的价值有限。而非结合胆红素(UCB)是未与葡萄糖醛酸结合的胆红素，在循环中主要与白蛋白结合以复合体的形式运输，难溶于水，具有脂溶性，可聚集、结合并通过细胞生物膜，是导致组织和器官损伤的关键。目前，临床上防治高胆红素血症常用的治疗方案主要包括光疗、换血、抚触及药物治疗等。每种方法都有一定的适应症，但还存在一定的局限性和安全性。因此，探索高胆红素血症血清UCB水平升高的发生机制，可为临床防治高胆红素血症及其并发症提供新的策略和方向。　　胆红素在人体内的代谢过程包括来源和生成、结合和运输、肝细胞的摄取和转化、排泄过程。其中，UCB主要以与白蛋白结合为复合体的形式在循环中运输，维持着血清UCB水平的动态平衡。而当血清白蛋白出现质量和/或亲和力的改变时，可导致UCB与白蛋白的结合力降低，是高UCB血症发生的重要机制之一。那么，高胆红素血症时是否存在血清白蛋白质量和/或亲和力的改变？其机制如何？目前尚未见报道。通过查阅文献，得知同型半胱氨酸(Hcy)及其衍生物可与蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基反应形成赖氨酸残基（称为蛋白质N-高半胱氨酸化）复合物，发生蛋白质Hcy化，从而改变了被修饰蛋白质的空间折叠和构象，导致蛋白质的分子结构和理化性质发生改变。而文献证实，高胆红素血症时存在血清Hcy水平的升高，且与高胆红素血症毒性损伤存在相关性。因此，本课题主要探索高胆红素血症时，是否存在血清Hcy水平升高，修饰白蛋白氨基酸残基位点发生白蛋白Hcy化，引起白蛋白的空间折叠和构象发生改变，竞争性抑制UCB与白蛋白的结合，导致高UCB血症的发生。　　研究方法:　　(1)选用新生7d Wistar大鼠皮下注射盐酸苯肼建立高UCB血症模型，全自动生化分析仪测定血清胆红素、白蛋白及Hcy浓度，Western-blot及K-Hcy抗体检测血清白蛋白Hcy化水平，HBABA染料结合法检测血清白蛋白-胆红素结合力;同时，探索抗Hcy（叶酸）对血清UCB浓度、白蛋白Hcy化水平、白蛋白-胆红素结合力的影响。　　(2)将L-同型半胱氨酸硫内酯(HTL)与人血清白蛋白(HSA)体外共孵育，通过Western-blot及K-Hcy抗体验证Hcy对HSA的修饰作用;运用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定与分析明确Hcy修饰HSA的具体氨基酸残基位点;氧化酶法测定Hcy修饰HSA与胆红素的结合力。　　(3)根据上述质谱分析结果，以Flag-HSA野生型基因为模板，运用PCR定点突变技术，体外构建定点HSA突变体的真核表达质粒;利用阳离子脂质体介导的转染技术，将HSA突变体质粒转染入HEK293细胞中，通过Western-blot法和免疫荧光法检测HSA突变体质粒的表达情况;利用免疫沉淀法纯化目的蛋白;利用氧化酶法检测HSA突变体与胆红素的结合能力。　　研究结果:　　(1)新生7d Wistar大鼠皮下注射盐酸苯肼能成功建立高UCB血症模型;与对照组相比，模型组血清Hcy浓度升高，白蛋白Hcy化水平增加，白蛋白与UCB的结合力降低;抗Hcy（叶酸）治疗可降低高胆红素血症血清白蛋白Hcy化水平和UCB浓度，增加白蛋白与UCB的结合力。　　(2)Western-blot结果显示，HSA被修饰水平随HTL浓度增加而升高;液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定与分析，第28位和569位赖氨酸是Hcy修饰HSA的具体氨基酸残基位点;氧化酶法检测Hcy修饰HSA与胆红素的结合力显著降低。　　(3)酶切及测序证实HSA突变体真核质粒构建成功;Western-blot和免疫荧光结果显示，HSA突变体质粒在HEK293细胞中的转染效率较高;利用Flag-标签抗体和免疫沉淀法成功获得了大量HSA突变体目的蛋白;氧化酶法检测HSA突变体与胆红素的结合力显著降低。　　研究结论:　　(1)高UCB血症存在血清Hcy和白蛋白Hcy化水平的升高，UCB与白蛋白结合力的降低。这说明高UCB血症与血清Hcy水平存在相关性。　　(2)高胆红素血症前期HSA水平没有改变，而白蛋白与UCB结合力却明显降低，这说明血清UCB水平的升高可能与HSA质量和/或亲和力的改变有关。　　(3)抗Hcy（叶酸）治疗可降低高胆红素血症Wistar大鼠血清UCB浓度、白蛋白Hcy化水平，增强血清白蛋白与UCB的结合力。这说明血清Hcy可作为评价高胆红素血症及其毒性损伤的生化指标，有望成为临床防治高胆红素血症及其毒性损伤的新策略和方向。　　(4)体外将HSA与HTL共孵育结果显示，HSA被修饰水平随HTL浓度增加而升高，证实了HSA可发生Hcy化修饰。且通过LC-MS/MS鉴定与分析，发现其具体氨基酸残基位点是HSA分子结构中的第28位和569位赖氨酸。这为下一步探索Hcy修饰HSA与胆红素的相互作用奠定了理论基础。　　(5)利用氧化酶法检测Hcy修饰HSA与胆红素的结合力降低。这表明Hcy修饰能抑制胆红素与HSA的结合，可能与改变HSA分子空间折叠和构象有关。　　(6)K28/K569位点的定点HSA突变体与胆红素结合力降低。这表明，Hcy修饰竞争性抑制HSA与胆红素结合，可能是高UCB血症发生的重要机制之一。　　综上所述，高UCB血症与血清Hcy浓度、白蛋白Hcy化水平、HSA与胆红素结合力存在明显的相关性;Hcy可修饰HSA分子氨基酸残基位点，改变HSA分子的空间折叠和构象，竞争性抑制胆红素与HSA的结合，是高UCB血症发生的重要机制之一;抗Hcy（叶酸）治疗有望成为临床防治高胆红素血症及其毒性损伤的新策略和方向。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分高未结合胆红素血症与同型半胱氨酸相关性的研究

背景与目的

材料与方法

结果

讨论

第二部分同型半胱氨酸与人血清白蛋白相互作用的研究

背景与目的

材料与方法

结果

讨论

第三部分同型半胱氨酸修饰竞争性抑制胆红素与人血清白蛋白结合的研究

背景与目的

材料与方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

文献综述：高胆红素血症神经毒性及其机制的研究进展

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢