苣荬菜改善芥子气中毒损伤的有效成分及初步机制研究

摘要

芥子气为糜烂性毒剂的典型代表，可直接损伤裸露的皮肤或其他器官，引起皮肤溃烂、黏膜坏死、脱落，吸收后还可造成全身中毒。芥子气曾多次被用于战争中，如两伊战争，日本侵华战争以及叙利亚内战等，均造成重大伤亡。芥子气性质稳定，作用持久，穿透性强，中毒途径多，且中毒机制复杂，尚无特效抗毒药物，在和平年代可能被恐怖分子用来制造恐怖袭击。芥子气在日遗化武中也占很大比重，其泄露事故对我国居民生命健康构成重大威胁，如2003年齐齐哈尔“8.4事件”，造成重大人员伤亡和社会恐慌。因此，积极开发防治芥子气的特效药物，对保持我军战斗力，维护国家安全具有重要意义。　　目前尚无理想的芥子气抗毒药物。而天然产物是许多临床应用药物的先导化合物，是巨大的药物资源库，多有文献报道天然产物用于改善芥子气所致机体损伤。苣荬菜是传统的民间药物，具有清热解毒，消肿排脓的功效。研究证实苣荬菜是一种有效、安全的抗氧化剂，能够显著清除机体内自由基，还能抗机体DNA损伤。另外，苣荬菜具有保肝作用，能够减轻CCl4引起的机体肝脏氧化应激损伤以及DNA损伤，使肝脏组织里的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶等抗氧化剂恢复正常水平。从苣荬菜植物体内分离得到的多个倍半萜单体成分也已经被证明能够在体外发挥抗菌、清除自由基等活性。　　本课题利用前期建立的芥子气小鼠中毒模型，检测苣荬菜粗提物改善芥子气损伤的作用，结果发现苣荬菜粗提物能够有效提高致死剂量芥子气染毒小鼠的生存率。为了进一步探寻有效的单体成分，通过生物活性追踪分离，最终分离得到了具有显著抗芥子气毒性作用的活性成分，利用现代波谱技术对其进行结构鉴定，确定了平面结构和立体构型，并进一步开展了相关的药理学和分子生物学研究，阐述了化合物初步作用机制，为将来苣荬菜在防治芥子气中毒方面的应用打下了基础。　　一、苣荬菜粗提物对芥子气中毒的改善作用　　采用皮下注射芥子气建立小鼠全身中毒模型，观察苣荬菜提取物对致死剂量芥子气染毒小鼠生存率的影响，结果发现中、高剂量的苣荬菜能够显著提高小鼠的生存率（p值均小于0.001），在此基础上，开展病理组织切片检查，评价药物作用的靶器官，结果发现芥子气染毒后，小鼠肺脏、肝脏、小肠、脾脏和结肠等多个器官都受到不同程度的损伤，而肝脏和小肠在给药干预后得到了明显的改善，因此，我们选取正常肝细胞L-02为模型，同时选择N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为阳性对照药物，进行了血清药理学试验，从细胞水平证明苣荬菜对芥子气损伤的保护作用。　　二、苣荬菜有效成分的活性跟踪分离与结构鉴定　　为了寻找苣荬菜防治芥子气的单体成分，在前期动物水平和细胞水平上均证实了苣荬菜粗提物对芥子气损伤改善作用的基础上，我们采用生物活性追踪的方法，采用硅胶，葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20），MCI(gel CHP-20P)，HW40-F，反相ODS等柱层析方法以及高效液相(HPLC)等经典的天然产物分离方法对苣荬菜粗提物进行提取分离，并对所得的化合物进行结构鉴定。生物活性追踪的方法采用L-02细胞，以CCK-8法进行生物活性检测，在分离的每一阶段对所得的馏分进行活性测定，追踪活性成分，进行苣荬菜活性部位及成分筛查。　　最终，我们分离并鉴定了48个化合物，其中包含11个倍半萜类化合物，10个三萜类化合物，11个甾体类化合物，5个酚类化合物以及11个脂肪族类化合物。在这48个化合物中，有2个为新化合物，命名为1βH，5βH，6αH，7αH，11αH-10，15-di-hydroxyguai-4(14),8-dien-12,6-olide和4-hydroxyl-11-methoxycarbonylguaiane-1(10),5,7(11)，8-tetraen-12，6-olide。进一步的药物活性筛选得到4个改善芥子气中毒作用的化合物，并明确了它们的药效剂量关系。　　三、苣荬菜粗提物及化合物11β，13-dihydro-santamarin(40)改善芥子气中毒损伤的初步机制研究　　首先，基于UPLC-Q-TOF-MS，我们对各组的肝脏和小肠进行代谢组学轮廓分析。肝脏和小肠中分别有32种和21种重要代谢物被鉴定为苣荬菜改善芥子气损伤的潜在生物标志物。通过检索KEGG通路数据库，寻找代谢通路网络，结果分析表明苣荬菜对芥子气损伤的改善作用主要与其对谷胱甘肽代谢、色氨酸代谢、核苷酸代谢和甘油磷脂代谢的干扰有关。谷胱甘肽代谢和甘油磷脂代谢提示该过程与炎症以及氧化应激相关，而色苷酸代谢和核苷酸代谢则提示该过程与核酸损伤、细胞死亡以及细胞毒性相关。　　根据上面结果提示，结合文献，我们进一步研究了化合物11β，13-dihydro-santama-rin(以下称化合物40)改善芥子气中毒损伤的作用机制。应用流式细胞术检测L-02细胞在芥子气染毒后的凋亡情况，芥子气染毒后，与阴性对照组（CTRL组）相比，芥子气组（SM组）细胞凋亡率显著升高(p＜0.001)，给予化合物40干预后，与SM组相比，化合物40组的细胞凋亡率明显下降(p＜0.001)。此外，蛋白免疫印迹检测发现芥子气染毒后，与CTRL组相比，SM组细胞内的促凋亡蛋白Caspase-3表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-XL和Bcl-2表达下降，而化合物40干预后，与SM组相比，细胞的Caspase-3表达显著下降，Bcl-XL和Bcl-2表达升高。可见，芥子气染毒可引起促凋亡蛋白Caspase-3表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达下降，导致细胞凋亡，而化合物40能够回调Caspase-3、Bcl-2和Bcl-XL的表达，降低细胞凋亡率，减弱芥子气引起的细胞损伤。　　通过ELISA检测细胞内的氧化应激相关指标MDA、SOD和GSH/GSSG，观察化合物40对于芥子气所致细胞内氧化应激水平的影响。与CTRL组相比，SM组细胞内MDA水平明显增加，而化合物40组能够降低MDA水平;总SOD活力和GSH/GSSG检测的结果表明，与CTRL组相比，SM组的SOD活性和GSH/GSSG显著下降，说明细胞清除自由基的能力下降严重，给予化合物40干预后，总SOD活力和GSH/GSSG显著上升。这些结果提示，当芥子气染毒后，脂质过氧化增加，清除自由基的能力下降，而给予化合物40后，氧化应激水平下降，细胞抗氧化能力、清除自由基的能力明显增加。通过蛋白印迹法评价L-02细胞中胞核和胞浆的Nrf2表达水平以及HO-1的表达水平，实验结果发现，与SM组相比，化合物40能够促进胞浆中的Nrf2入核，增加胞核中Nrf2的表达，激活下游蛋白HO-1的表达，提示Nrf2/HO-1通路是发挥抗氧化应激作用以及改善芥子气损伤作用的关键信号通路。　　本文以芥子气染毒细胞为模型，活性追踪中草药中的活性化合物，首次证实了苣荬菜改善芥子气损伤的作用，分离并筛选得到4个具有芥子气损伤改善作用的化合物，并初步探究了化合物40改善芥子气损伤作用的机制，基于上述实验结果，我们在未来的工作中将对药物在动物水平上的药理作用以及抗毒机制做更深入更细致的探讨，以期为苣荬菜的应用打下坚实的基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章苣荬菜对芥子气中毒的改善作用

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

第二章苣荬菜有效成分的活性跟踪分离与结构鉴定

二、材料与方法

三、结果

四、小结

第三章苣荬菜粗提物及化合物40改善芥子气损伤的初步作用机制

一、苣荬菜粗提物对芥子气中毒动物的初步代谢组学研究

二、化合物40对芥子气损伤改善作用的初步机制研究

三、讨论与小结

全文总结

参考文献

文献综述 天然产物防治化学战剂的研究概况

附录

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢