SEC5蛋白与InsP3R相互作用调控抗白念珠菌固有免疫

摘要

白念珠菌作为条件致病菌寄生在健康人体的口腔和小肠粘膜中，当机体免疫力低下时，其可侵入机体引发系统性感染。系统性白念珠菌感染是最常见的院内真菌感染，包括念珠菌血症和深部组织感染。系统性白念珠菌感染患者死亡率较高，即使接受药物治疗，死亡率仍可高达40％。因此，在治疗过程中，改善患者的机体免疫力被认为是增强治疗效果的理想手段。入侵机体后，白念珠菌表面的病原相关分子模式被免疫细胞中表达的模式识别受体识别后激起机体的免疫反应。目前研究已发现多种识别白念珠菌的模式识别受体，如Toll样受体，C型凝集素受体等。白念珠菌表面的β葡聚糖和甘露糖能够分别结合C型凝集素受体Dectin-1和Dectin-2，激活磷脂酶Cγ(PLCγ)，产生(1，4，5)-三磷酸肌醇(inositol1，4，5-trisphosphate，InsP3)。InsP3结合InsP3R(InsP3R)引发内质网中钙离子的释放，使胞内钙离子浓度升高。细胞内钙离子调控多种细胞免疫功能，如活性氧的产生，细胞因子分泌和吞噬等。本课题从酵母双杂交实验筛选到SEC5蛋白能够结合InsP3R的碳末端出发，对SEC5与InsP3R的相互作用及其对抗白念珠菌固有免疫的影响进行了研究。　　第一部分，SEC5与InsP3R相互作用。首先通过GST pull down实验和CO-IP实验验证了酵母双杂交实验的筛选结果，从蛋白水平证明SEC5与InsP3R结合。免疫荧光共定位实验发现SEC5与InsP3R主要分布在细胞质中，并在细胞核周围与InsP3R共定位明显。荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)实验证明SEC5与InsP3R共定位区域的空间距离小于10nm，提示SEC5与InsP3R在细胞内直接相互结合。为进一步验证我们的假设，我们对SEC5与InsP3R相互作用的区域进行了深入探索。InsP3R的C末端含有4个α螺旋结构域(H1-H4)，分别构建GST-H1/H2/H3/H4融合表达质粒，转化大肠杆菌，表达纯化获得GST-H1/H2/H3/H4融合蛋白beads，并与RAW264.7细胞裂解液进行GST pull down实验，结果发现H1片段能够结合裂解液中的SEC5蛋白。为研究SEC5与InsP3R-H1的结合区域，将SEC5蛋白分为4段(SEC5-1/2/3/4)，融合His标签在大肠杆菌中表达。用纯化得到的GST-InsP3R-H1beads与表达有SEC5-1～SEC5-4蛋白片段的大肠杆菌裂解液进行pull down实验，结果发现SEC5-2段和SEC5-4段能够结合InsP3R-H1。综合本部分实验结果表明，SEC5作为一个新的InsP3R相互作用蛋白，直接结合于InsP3R的碳末端。　　第二部分，SEC5-InsP3R相互作用调控InsP3R离子通道活性。首先利用钙离子成像实验检测SEC5-InsP3R相互作用对细胞内钙离子浓度变化的影响，结果发现，在HEK293细胞中，SEC5过表达能够促进卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子浓度的升高，而下调SEC5的表达能够抑制卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子的升高。InsP3R特异性的抑制剂Araguspongin B(ARB)能够抑制SEC5对卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子的升高的促进作用。为了验证SEC5与InsP3R的相互作用对InsP3R介导的钙离子释放的影响，我们设计并合成了能够透过细胞膜，并具有干扰SEC5与InsP3R的相互结合作用的干扰多肽H1-TAT及其对照多肽H1S-TAT。利用CO-IP实验进行验证后，证明HI-TAT能够抑制SEC5与InsP3R的结合。利用钙离子成像实验检测经H1-TAT及对照多肽H1S-TAT处理的细胞，发现H1-TAT能够抑制对照细胞和SEC5过表达细胞中卡巴胆碱引起的胞内钙离子的升高，进一步证明SEC5与InsP3R的相互作用影响InsP3R介导的钙离子释放。为考察SEC5是否直接影响InsP3R的离子通道活性，利用体外表达纯化的SEC5-2多肽片段进行膜片钳电生理实验，检测结果发现，在相同的InsP3浓度刺激条件下，SEC5-2多肽能够增强InsP3R的活性。综合本部分研究结果，说明SEC5与InsP3R相互作用，能够直接调控InsP3R离子通道的活性，并影响细胞内钙离子的升高。　　第三部分，SEC5蛋白与InsP3R相互作用影响小鼠巨噬细胞对白念珠菌的吞噬。首先通过钙离子成像实验发现BMDM细胞吞噬白念珠菌起始阶段细胞内钙离子浓度瞬时升高。而用细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM和InsP3R特异性抑制剂ARB预处理，能够抑制BMDM对白念珠菌的吞噬作用，说明InsP3R介导的胞内钙离子的释放影响巨噬细胞的吞噬作用。为考察SEC5在BMDM吞噬白念珠菌中的功能，利用转染过表达质粒或siRNA的方法改变细胞中SEC5蛋白的表达水平，结果发现在BMDM细胞中过表达SEC5能够显著促进BMDM对白念珠菌的吞噬作用，相反，下调SEC5表达能够抑制BMDM的吞噬功能。免疫荧光实验发现SEC5与InsP3R在吞噬小体上有明显共定位;同时，CO-IP实验结果表明白念珠菌刺激能够促进SEC5与InsP3R的结合。用H1-TAT多肽干扰SEC5与InsP3R的相互作用，能够显著抑制BMDM细胞的吞噬作用。上述研究结果说明SEC5与InsP3R的相互作用影响BMDM细胞对白念珠菌的吞噬作用。　　第四部分，SEC5与InsP3R相互作用调控TBKI-IRF3通路介导的抗白念珠菌天然免疫反应。首先利用白念珠菌刺激BMDM细胞，并用western blot实验检测TBK1的磷酸化激活水平及转录因子IRF3的入核情况，发现白念珠菌刺激能够激活TBK1-IRF3通路，而下调SEC5蛋白表达能够抑制该通路的激活。GST pull down实验发现InsP3R能够与SEC5，TBK1形成复合体，并且白念珠菌刺激促进该复合体的形成。进一步的机理研究发现在SEC5蛋白分子内，SEC5-2片段和SEC5-rbd结构域结合，阻碍SEC5-rbd与TBK1的结合，对SEC5-rbd结构域产生自我抑制。InsP3R的H1段与SEC5-rbd竞争性结合SEC5-2区域。InsP3R的H1段结合SEC5时能够将SEC5-rbd结构域从SEC5-2区域中解离，促进SEC5-rbd与TBK1的结合，导致TBK1的激活。　　综上四部分实验研究结果，我们发现并验证了SEC5为一个未经报道的InsP3R相互作用蛋白，并且能够调控InsP3R离子通道活性，影响InsP3R介导的细胞内钙离子的释放。同时，我们发现SEC5与InsP3R的相互作用影响巨噬细胞对白念珠菌的吞噬，并调控TBK1-IRF3通路介导的抗白念珠菌天然免疫，发现了机体抗白念珠菌免疫反应的一种新的分子调节机制，为临床抗白念珠菌免疫治疗提供了新的理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

参考文献

第一部分 SEC5与InsP3R相互作用

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．2．1 实验主要材料

1．2．2 主要实验方法

1．3 实验结果

1．3．2 SEC5蛋白与InsP3R细胞内免疫荧光共定位

1．3．3 SEC5蛋白与InsP3R细胞内FRET实验

1．3．4 InsP3R结构中与SEC5相互作用区域的研究

1．3．5 SEC5结构中与InsP3R相互作用区域的研究

1．4 小结

参考文献

第二部分 SEC5-InsP3R相互作用影响InsP3R离子通道活性

2．1 前言

2．2．2 主要实验方法

2．3 实验结果

2．3．1．HEK293细胞Crynkiewicz常数测定

2．3．2 SEC5表达水平对InsP3R介导的细胞内钙离子释放的影响

2．3．3 SEC5与InsP3R相互作用影响InsP3R介导的钙离子释放

2．3．4 SEC5直接影响InsP3R离子通道活性

2．4 小结

参考文献

第三部分 SEC5蛋白与InsP3R相互作用影响巨噬细胞对白念珠菌的吞噬

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验主要材料

3．2．2 主要实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 BMDM细胞吞噬起始阶段细胞内钙离子浓度升高

3．3．2 InsP3R介导的钙离子释放影响巨噬细胞对白念珠菌的吞噬作用

3．3．3 SEC5蛋白影响巨噬细胞对白念珠菌的吞噬作用

3．3．4 SEC5蛋白与InsP3R在吞噬小体上共定位

3．3．5 白念珠菌刺激促进SEC5与InsP3R蛋白结合

3．3．6 干扰SEC5与InsP3R的相互作用抑制BMDM细胞对白念珠菌的吞噬

3．3．7 体内干扰SEC5与InsP3R的相互作用影响体内白念珠菌清除

3．4 小结

参考文献

第四部分 SEC5与InsP3R相互作用调控TBK1-IRF-3通路介导的抗白念珠菌天然免疫反应

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验主要材料

4．2．2 主要实验方法

4．3 实验结果

4．3．1 SEC5稳定低表达的RAW264．7细胞株建立

4．3．2 SEC5蛋白调控白念珠菌引起的TBK1-IRF-3信号通路的激活

4．3．3 白念珠菌刺激促进InsP3R-SEC5-TBK1复合体形成

4．3．4 H1多肽促进SEC5蛋白与TBK1结合，促进TBK1酶活

4．3．5 SEC5-RBD与InsP3R-H1竞争结合SEC5-2段

4．4 小结

参考文献

总结

综述

致谢