大丽轮枝菌分泌蛋白质组学及酵母同源蛋白的结构和功能研究

摘要

大丽轮枝菌是广泛分布在土壤中的一种病原真菌，可以引起植物黄萎病，在全世界范围内造成巨大的经济损失。大丽轮枝菌不但可以让植物叶片大面积发黄褪色，更为严重的是可以入侵到植物体内，堵塞导管和维管束，最后造成植物坏死和腐烂。但是，目前还未发现有效根治黄萎病的方法，对大丽轮枝菌如何入侵植物体内的理解不够清晰，对宿主植物和大丽轮枝菌的具体互作机制也不清楚，大丽轮枝菌毒力相关蛋白的功能研究也还处在初步阶段。
　　有文献报道，病原真菌在低氮的环境条件下入侵植物，很多与病原真菌毒力有关的激发子蛋白迅速诱导表达，这也和病原真菌入侵植物时面临的营养缺乏时氮源利用相关基因的大量表达是相似的。营养压力，特别是低氮限制的压力也被证明是影响病原真菌生长和发育最关键的因素之一。总之，当病原真菌入侵植物时，植物内环境对真菌而言是一个氮源限制的环境，或者说在体外可以通过氮源限制来模拟病原真菌入侵植物时的内部环境。
　　在致病菌与植物的相互作用过程中涉及到众多的信号分子的识别与传导。其中，真菌的分泌蛋白在这个过程中起着不可或缺的作用。事实上，这些病原真菌的致病性因子和激发子蛋白都是需要分泌到细胞外才能行使其生物学功能。
　　近年来，随着基因组测序技术的迅猛发展，大量植物病原菌基因组的序列被测定，因此利用这些数据库平台并借助蛋白质组学的方法可以鉴定这些病原菌中的关键毒力因子蛋白。我们利用凝胶电泳后切胶回收和直接在溶液中进行酶解两种方法，并结合多维液相色谱与质谱联用技术(LC-MS/MS)研究了大丽轮枝菌在低氮限制条件下分泌的蛋白质组。我们共鉴定出214个蛋白质，通过序列分析和GO(Gene Ontology)基因功能注释，发现它们包括与细胞结构相关的10类蛋白、与分子功能相关的8类蛋白以及参与生物过程处理的19类蛋白。通过细胞定位的分析，我们筛选出33种分泌蛋白，这些蛋白的等电点分布从4.56到9.51，分子量为13-86 kDa。结合NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对和GO基因功能注释，可以将这些分泌蛋白大致分为6大类型:激发子蛋白和免疫原性蛋白、降解/重建细胞壁相关酶类、蛋白酶和酯酶类、能量代谢和蛋白代谢调控蛋白、氧化还原酶类、未知功能蛋白。降解/重建细胞壁相关酶类负责突破植物细胞壁屏障，激发子蛋白以及免疫原性蛋白会启动植物的免疫反应，其他一些代谢相关蛋白负责消除入侵过程中的氧化压力和营养限制，保证自身的营养供给和能量来源，最终完成侵染植物的过程。
　　我们对分泌蛋白质组学的研究为鉴定大丽轮枝菌的毒力因子奠定了基础，并为进一步研究黄萎病的生物防治提供了理论指导。
　　同时，我们对上述的一个分泌蛋白磷脂酰甘油/磷脂酰肌醇转移蛋白(PG/PITP)酿酒酵母中的同源蛋白Npc2在大肠杆菌中进行了重组表达，并利用亲和层析和分子筛的方法纯化了该蛋白，进行了晶体初筛和优化实验，已收集一套3.3(A)分辨率的X射线衍射数据。
　　此外，我们还对苏云金芽孢杆菌Cry1Aa质粒进行了单点突变工作，获得了Cry1Aa的单点突变蛋白（Cry1AaH168R，Cry1Aa N372G和Cry1Aa N372A），通过细胞学快速检测方法，获得提高Cry1Aa杀虫活性的有效方法。

目录

声明

摘要

第一部分 大丽轮枝菌分泌蛋白质组学研究

第一章 大丽轮枝菌的研究背景

1．1 引言

1．2 氮信号对植物病原真菌的意义

1．3 真菌分泌蛋白的作用

1．4 宿主植物对大丽轮枝菌病原菌分泌蛋白的响应

1．5 植物致病真菌的蛋白组学、分泌蛋白组学研究进展

第二章 实验材料、仪器设备与方法

2．1 实验材料、试剂与仪器设备

2．2 实验方法

第三章 结果与讨论

3．1 大丽轮枝菌在正常培养条件下和低氮限制条件下的生物量变化

3．2 质谱鉴定的实验结果和二次筛选后的实验结果

本篇小结

参考文献

第二部分 酿酒酵母Npc2蛋白的结构与功能研究

第四章 Npc2蛋白的研究背景

4．1 引言

4．2 Npc2基因的鉴定

4．3 Npc2蛋白的功能分析

第五章 实验材料、仪器设备与方法

5．1 实验材料、试剂与仪器设备

5．2 实验方法

第6章 结果与讨论

6．1 Npc2蛋白的表达与纯化

6．2 Npc2蛋白的晶体学结果

6．3 Npc2蛋白的序列比对分析

本篇小结

参考文献

第三部分 Gry1Aa突变蛋白的功能研究

第7章 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的研究背景

7．1 引言

7．2 Cry蛋白的结构分析

第八章 实验材料、仪器设备与方法

8．1 实验材料、试剂与仪器设备

8．2 实验方法

第九章 结果与讨论

9．1 Cry1Aa蛋白的纯化结果

9．2 Cry1Aa突变蛋白的毒力筛选结果

9．3 Cry1Ac10蛋白的表达纯化及晶体学结果

本篇小结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文、取得的其他研究成果以及参加的学术会议