山核桃幼胚不同发育时期DNA甲基化水平和模式的研究

摘要

DNA甲基化修饰在动植物基因组中普遍存在,是一种重要的表观遗传学表现形式。在植物中,DNA甲基化修饰参与基因组所有功能,包括转录、复制、DNA修复、基因重排和细胞分化等,DNA甲基化对植物基因组防御、调控基因表达以及控制植物的生长和发育中起重要作用,对植物本身有着积极的意义。　　本研究利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分子标记技术对山核桃幼胚生长发育的不同时期基因组总DNA甲基化水平和动态变化进行分析,进一步揭示山核桃幼胚发育过程中甲基化变化规律,为建立高效的山核桃体细胞胚发生体系提供理论依据。主要研究结论如下:　　(1)本实验对不同时期山核桃幼胚 DNA甲基化分析的预扩增和选扩增后用1％的琼脂糖凝胶电泳发现,所有预扩增条带呈弥散分布,表明山核桃幼胚预扩增的条带片断大小相近,而选择性扩增产物在100bp-750bp之间,并且可以看到不同时期条带的差异性,可以方便筛选选择性扩增引物,提高实验的效率。　　(2)将 MSAP条带进行统计分析,在山核桃自然授粉后第12周甲基化水平达到最高为32.48%,在第9周和第10周为最低为26.34%,表明山核桃幼胚的不同发育时期总 DNA胞嘧啶甲基化有较大的差异,在发育过程中呈现一定规律性变化。　　(3)山核桃幼胚不同发育时期,即使甲基化水平一样,甲基化类型也是所不同,第9周和第10周甲基化水平相同都为26.34%,但是第9周半甲基化为6.91%,全甲基化为19.43%;而第10周半甲基化为10.48%,全甲基化情况为15.86%。半甲基化位点从第10周起到第16周呈明显下降趋势,而全甲基化情况,呈明显的上升趋势。　　(4)山核桃幼胚发育的过程中伴随着去甲基化的变化,在第12周到第13周去甲基化位点变化最明显,去甲基化位点为22个,并且甲基化和去甲基化情况在幼胚发育的每个时期都存在。　　(5)山核桃不同时期幼胚诱导过程中,胚性感受细胞与不同时期基因组甲基化水平和类型有密切关系,在胚性感受细胞容易产生的时期,从第9周到第12周甲基化水平和类型有明显变化,并且在第13周甲基化水平和类型趋于稳定,胚性感受细胞不易产生。胚性感受细胞受到甲基化和去甲基化共同调控基因表达影响。　　(6)选取山核桃幼胚同一位点甲基化在不同发育时期发生改变的特异性位点进行片段回收测序,发现回收片段在100-300bp之间,进行序列比对得到了一个NADP脱氢酶亚基的同源序列,表明DNA甲基化发生对山核桃胚胎发育正常进行有重要作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 文献综述

1.1DNA甲基化在植物发育的研究进展

1.1.1DNA甲基化形成机制

1.1.2植物中DNA甲基化类型

1.1.3 DNA甲基化在植物发育中作用

1.1.4 DNA甲基化对植物基因组印迹的调控

1.1.5 DNA甲基化对植物春化的影响

1.1.6 DNA甲基化对木本植物体细胞无性系变异的研究

1.2 DNA甲基化分析与检测方法的研究进展

1.2.1甲基化敏感扩增技术由来

1.2.2 MSAP技术的原理

1.2.3 MSAP技术的操作程序

1.2.4 MSAP技术的应用

1.2.5 MSAP技术的不足和展望

1.3本研究的背景、目的和意义

2山核桃幼胚不同发育时期MSAP研究

2.1实验材料

2.2主要试剂

2.3主要仪器

2.4实验方法

2.4.1山核桃不同时期幼胚DNA的提取和纯化

2.4.2山核桃幼胚DNA质量和浓度的检测

2.4.3山核桃幼胚DNA甲基化敏感多态性（MSAP）实验

2.5实验结果与分析

2.5.1山核桃幼胚8个发育时期采样

2.5.2山核桃幼胚基因组DNA提取分析

2.5.3山核桃幼胚基因组DNA双酶切分析

2.5.4山核桃幼胚基因组DNA预扩和选扩的分析

2.5.5山核桃幼胚不同时期MSAP分析

2.5.6山核桃幼胚不同发育时期甲基化变化的分析

3 山核桃幼胚MSAP甲基化特异性片段分析

3.1山核桃幼胚甲基化特异性片段回收试验方法

3.2 MSAP特异性片段的测序和比对分析

4讨论

5结论与展望

参考文献

致谢

个人简介